VITEK-MS仪器介绍

生物梅里埃公司…将质谱技术实现于临床细菌检测和鉴定的常规分析…22现代微生物的分类:蛋白质组及基因组proteinbacterialcellDNAgenomeproteomeDNAfingerprint30005000700090001100013000Mass(m/z)2117.30102030405060708090100%IntensityVoyagerSpec#1=AdvBC(32,0.5,1.0)=NF0.7[BP=4423.9,2117]4424.29476.24861.08823.55897.86271.28054.36629.07424.912271.44738.66984.68383.86786.76533.39075.23132.36137.37209.88903.38610.610110.84765.410975.24026.94535.63311.810493.93491.49611.5massfingerprintspeciesdefinition&determination质量指纹图谱基因指纹图谱3什么是质谱MassSpectrometry?定义：用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。20世纪初，J.J.Thomson创制了抛物线质谱装置：阴极射线在电场作用下发生偏转。4质谱仪简单构造进样系统离子源质量分析器检测器基本构造及功能（高真空系统）：首先，在离子源中，使分子离子化；其次，带电分子的离子及其碎片必须根据其质荷比来得到分离，这往往在质量分析器中进行；最后，分离的带电荷的碎片必须通过检测器检测。5离子源分类用于同位素质谱、无机物质谱、有机物质谱的电离方式电子轰击电离（electronimpact,EI)化学电离（Chemicalionization,CI)大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionization,APCI)然而以上电离方式产生的能量传输容易导致蛋白质破碎，故不适用于生命科学6离子源分类诞生于20世纪80年代的软电离技术，具有高灵敏度和高质量检测范围。使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域电喷雾电离（Electrosprayionization,ESI)快原子轰击（Fastatombombardment,FAB)基质辅助激光解吸电离质谱技术MALDI-TOF(MatrixAssistedLaserDesorption/Ionisation-TimeofFlight)最柔软的电离方式保证完整分子量信息，例如蛋白质/多肽;直接从细菌核糖体中筛选蛋白质;一般都使用飞行时间检测器（TimeofFlight）来检测，故名。7MALDI的原理和特点•最新“柔软”电离技术，它允许完整检测生物分子原理如下：将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相•广泛的质量范围质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。•可以鉴定混合菌种，但需要先提纯•高灵敏度（1000CFU）•高分辨率和质量图谱更准确8诞生过程PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative9梅里埃的承诺2009:bMx’internalmassspecdevelopments收集所有的菌种，建立临床应用的细菌数据库May2010:收购SARAMIS细菌数据库（+2000个菌种，+60000谱）June2010:与合作Co-developmenttooptimizemassspectrometryformicrobiologylaboratoriesShimadzu发明MALDI-TOF微生物体外诊断领导者10知识产权欧洲共同体专利EU1253622-E1MethodofidentifyingmicroorganismsusingMALDI-TOF-MSGrantedDecember2007利用MADLI-TOF质谱鉴定微生物11•1987:Shimadzu’sKoichiTanakaintroduceshiscobalt/glycerolmatrixforMALDIinTakarazukaJapan•2002年，田中耕一获得诺贝尔化学奖。与MALDI发明家合作开发12原理示意图PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative13简单工作流程步骤1步骤2加入基质步骤4上机步骤5开始读数及分析样品靶细菌、霉菌、酵母、分枝杆菌的菌落步骤3空气干燥几分钟PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative14MALDI原理示意图（1）激光样品(A)与基质(M)样品靶ammmmmmmmaaaa++++mam+1)用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜2)过程中将质子转移到生物分子MH++AM+AH+基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）15TOF飞行时间质量分析器（2）+++++iondetectorLineartime-of-flightmassspectrometerlmassrangeupto500kDaTOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测离子的质荷比（M/Z）=离子的飞行时间成正比16iondetector++++飞行时间的结果会显示在示波镜和电脑上离子检测器（3）1717MALDI-TOFMSataglance解吸电离加速分离离子检测离子检测器++++++模板matrix/analytecrystalsaccelerationzonefield-freedriftrange电极环工作流程19PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative今天具备….主要组合样品准备工作站VITEKMS主机（MALDI－TOF）数据采集工作站Myla（连接LIS）为感染治疗服务的质谱系统20标本准备工作Fungiandmycobacteria:On-targetextractionwith25%formicaciddirectadditionof1.0µLmatrixsolutionsolventevaporationatroomtemperatureautomatedMSanalysisMALDItarget21样品板－－低成本每块样品板有条形码、48个检测孔及3个对照，可以分开3次使用，即每16个测试包含1个质控。22商品化的试剂23高通量PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative4位技师同步准备4x48spots=192标本/批可追溯性及内部质控节省时间24速度快：以“分钟”计时间(分钟)工作步骤n=5标本n=24标本n=96标本准备标本1516准备基质1310干燥227读数及分析51243总共922761分钟完成1-2菌株鉴定25VITEKMS标本准备工作站VITEKMSVITEK2AST可追溯性•扫描样本板条码•输入每个标本号码整合VITEK2AST26VITEKMS数据采集工作站实时显示实验进程提示需要重新测试的样品27VITEKMS数据采集工作站28VITEKMS检测核糖体蛋白质重复性高：检测固定表达的高含量蛋如核糖体蛋白宽泛的质量范围2000-20000道尔顿TheribosomeofE.colihasabout22proteinsinthesmallsubunit(labelledS1toS22)and34proteinsinthelargesubunit(L1toL36).29质控菌株ATCC8739E.colicells3000400050006000700080009000100001100012000m/z43655380625450966315974472729065953964109229955883267871887865478369476831617706889943876506733231465402624091951030651183639572568554349731383937893988210700111887157Protein[M+H]average50SL36RpmJ4365,430SS22RpsV5096,850SL34RpmH5381,450SL33RpmG6241,450SL33(methylated)RpmG6255,450SL32RpmF6316,250SL30RpmD6411,6unknownProteinYcaR6856,150SL35RpmI7158,850SL29RpmC7274,550SL31RpmE7872,1sexfactor(experimental)*974350SL22RplV12227,3ForE.coliK12strainsanumberofexactaverageproteinmassesareknownthatareusedascalibrants30细菌质量指纹图谱4000m/z8000扩展到新的菌种和应用（用户不断增加细菌数据库）4000m/z8000BurkholderiacepaciaRaoultellaornithinolyticaStaphylococcusaureusPantoeaagglomeransAcinetobacterlwoffiEscherichiacoli检测细菌的核糖体蛋白不同波形代表不同菌种31MylaTM主脑PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative32Myla:VITEKMS状态33Myla:VITEKMS结果分析34Myla:VITEKMS结果分析35VITEKMS/Myla:MylaTM服务器VITEKMS数据处理分析PowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegativePowerIonisingVacuumNegative准备工作站VITEK2ID/ASTLIS工作流程信息流程BacT/Alert36强大的菌种库供您选择VITEK®MSRUO科研用途Saramis数据库2000+菌种临床环境VITEK®MS体外诊断利用MYLA连接鉴定及药敏检测近800临床菌种细菌酵母菌/霉菌/皮肤癣菌分枝杆菌37VITEK-MS体外诊断菌种库细菌及真菌总共(菌种)753细菌(菌种)643真菌(菌种)110临床菌种覆盖一般细菌酵母/霉菌分枝杆菌覆盖了微生物学实验室出现的大多数菌种大中华区菌种库合作计划开启微生物研究新时代39临床微生物常规鉴定现在情况:细菌和酵母菌株的鉴定主要是根据表型试验包括革兰氏染色，培养和生长特性和生化试验可靠的方法但耗时鉴定结果在第二天需要更快的鉴定结果以改善病人护理和提供适当抗生素疗法40MALDI-TOFMS：质的飞跃轻松、快速诊断人类病原体证明是一个可靠和快速的方法进行中的革命性改变:020406080100%Int.4000600080001000012000140