呼吸道标本采集和结果解读

1破解呼吸道感染病原学诊断的困境：需要你我他王辉北京大学人民医院检验科Email：[e-mail].04.2016.50592内容呼吸道感染病原学困境和挑战可能的破解之道2王辉-实验诊断学3TheThreeMostImportantElementsinPracticingMedicineWilliamOsler,ThePrinciplesandPracticeofMedicine,1892Diagnosis!Diagnosis!Diagnosis!Medicineisascienceofuncertaintyandanartofprobability.最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手头清楚的事4欧洲流调：CAP的主要病原体病原体检出率(%)一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患者,85%住院患者)，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。CillónizC,etal.Thorax.2011;66(4):340-346.•肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14635我国CAP的主要致病菌病原体检出率(%)入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测•2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致病菌，其次为肺炎链球菌1•在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常见的致病原2,3•混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多11.刘又宁陈民钧赵铁梅等.中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8；LiuYetal.BMCInfectiousDiseases.2009;9:31.3.TaoLLetal.ChinMedJ(Engl).2012;125(17):2967-2972.6成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%JenningsLC,etal.Thorax2008;63:42-8.RuuskanenO.Lancet2011;377:1264-75.6病毒科病毒种核酸类型正粘病毒科流感病毒单股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人类偏肺病毒单股RNA披膜病毒科风疹病毒单股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的部分型别单股RNA腺病毒科腺病毒双股DNA冠状病毒科人类冠状病毒、SARS冠状病毒单股RNA疱疹病毒科单纯疱疹病毒、带状疱疹、EB和CMV双股DNA细小病毒科人类博卡病毒单链DNA呼肠孤病毒科呼肠孤病毒（1，2，3，4型）双链RNA7PathogenidentifiedPatientsn(%)RespiratoryViruses262(27.5)InfluenzavirusA94(9.9)Humanrhinovirus41(4.3)Adenovirus40(4.2)Humanmetapneumovirus17(1.8)Parainfluenzavirustype116(1.7)Parainfluenzavirustype314(1.5)Parainfluenzavirustype211(1.2)InfluenzavirusB6(0.6)Humanenterovirus5(0.5)RespiratorysyncytialvirustypeA5(0.5)RespiratorysyncytialvirustypeB4(0.4)CoronavirusOC43/HKU14(0.4)Coronavirus229E/NL634(0.4)Parainfluenzavirustype41(0.1)Bocavirus0(0.0)北京市成人CAP监测网：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。JiuXinQu.BMCInfectDIs2015onlinefirst78上呼吸道标本类型及适应症8上呼吸道感染标本的采集9用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）咽拭子的采集方法咽拭子的采集正确拿咽拭子的方法错误拿咽拭子的方法上呼吸道感染标本的采集上呼吸道感染标本的采集11请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用力，当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子鼻拭子标本的采集病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧光定量PCR结果细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4℃冰箱内，严禁-20℃冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检12上呼吸道感染标本的采集支原体保存液病毒采样拭子细菌采样拭子13下呼吸道标本类型及适应症1314下呼吸道标本类型及适应症14下呼吸道标本中，痰&支气管镜标本最为重要！Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534标本的质量标本的质量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534标本的质量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534Inconclusion,sputumGramstainishighlyspecificfortheetiologicdiagnosisofCAPandHCAPandusefulinguidingpathogen-targetedantibiotictreatment病例1•男性，64岁•既往史：•心肌梗死2次•严重的充血性心力衰竭，行双侧冠状动脉旁路移植手术•心脏移植（植入式心脏复律除颤器）•症状：呼吸困难、干咳、低热•初步诊断：•支气管肺泡灌洗：无致病菌，正常菌群（真菌和分枝杆菌）•胸片：右下肺局限性密度影肺癌？SeifertH.CID,2009,48:S238-45手术，抗菌药物患者治愈•血培养：•初次：类白喉杆菌（皮肤污染）•第二次：马红球菌（免疫缺陷宿主的条件致病菌）•最终诊断：细菌性肺炎•治疗：红霉素，3个月，治愈微生物结果—条件致病菌感染诊断关键肺内肿块基本吸收SeifertH.CID,2009,48:S238-45医院获得性肺炎（HAP）的微生物标本采集和送检要求病原检验项目最优标本转运要求；送检最佳时间铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血杆菌血培养血培养已经注入标本的培养瓶室温下尽快送抵实验室。革兰染色定量或半定量需氧和厌氧细菌培养痰；支气管抽吸物；支气管肺泡灌洗液；PSB；肺组织无菌杯或管，室温，2h肺炎链球菌同上尿液无菌容器，室温，2h混合厌氧菌（吸入）革兰染色培养PSB标本肺组织无菌管；无菌容器放组织；室温，2h曲霉菌属真菌涂片或其他真菌染色方法支气管抽吸物无菌杯或管，室温，2h真菌培养支气管肺泡灌洗液；PSB半乳甘露聚糖（GM）1-3β-D葡聚糖（G）血清支气管肺泡灌洗液促凝管，室温，立即送检无菌杯或管，室温，2h20老年CAP患者的病原学诊断•2011年ERS/ESCMD指南建议所有住院患者均应进行血培养•北美指南建议对更严重的患者进行血培养•血培养有助于确诊潜在的肺炎病原体和根据分离病原菌对疾病进行重新评估血培养染色法呼吸样本培养尿抗原检测•对初始抗生素治疗方案调整具有重要的影响作用•但同样的呼吸道标本缺乏较高的预测•老年患者存在功能障碍：无法获得可评价的痰液；口咽定植的G-菌、金黄色葡萄球菌和MDR菌较多•肺炎链球菌和嗜肺军团菌的细菌抗原采用尿免疫层析技术检测•肺炎链球菌抗原的敏感性约大于60%，成人患者大于90%•军团菌抗原检测的敏感性大于90%老年CAP患者的病原学诊断方法González-CastilloJ,etal.RevEspQuimioter.2014;27(1)：69-8622指南中强调：血培养至少送2套•在发热开始的24h内进行血培养。•尽力保证在抗感染治疗前获得首份血培养标本。•同时经2个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床意义。除外新生儿外，不建议只进行单套血培养（Ⅱ级）。•48-96h后评估治疗效果，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取2套标本（Ⅱ级）。•但对怀疑血管内的感染，则应该间隔一段时间取不同部位的静脉穿刺抽血，有助于诊断持续性菌血症（Ⅱ级）。CritCareMed2008Vol.36,No.4；CLSI指南；英国指南23“双抽四瓶”，每瓶8-10ml标示“左侧”、“右侧”无菌体液如胸水等手册宣讲24痰标本在病原学诊断中面临的困难•CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰•痰标本合格率较低，甚至送检唾液•培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技能•涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可以辨别出主要形态类型24AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)25痰标本不同外观25唾液脓痰粘液样痰带血痰2626标本质量评估－痰涂片Garbagein！唾液27一个小调查•随机调查中国15家医院2014年痰标本数据27是73%否27%是否每份痰标本都涂片是20%否80%是否每份痰标本都半定量培养28痰标本判读标准的比较2829合格痰标本：吞噬很重要29WBC内吞噬：葡萄球菌30涂片项目报告格式30普通细菌涂片及染色31痰培养标本质量情况总数不合格不合格率儿科9777.78%内科2620188371.87%急诊64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%妇产科231356.52%门诊26715056.18%ICU121555745.84%13家医院，痰标本合格率不足50%32粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2015,21:260–27133对于确诊IA：GM的诊断效能CurrOpinPulmMed2015,21:260–27134粒缺肿瘤肺炎：微生物学评价BAL是很好的诊断工具CurrOpinPulmMed2015,21:260–27135恶性粒细胞减少患者的肺炎诊断•临床评估+微生物学评估+分子•微生物学评估：①最可靠：从无菌部位分离or呼吸道分泌物中非共生菌②BAL是首选下呼吸道标本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延误治疗③支气管活检（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培养不优于BAL，且因为恶性粒细胞减少继发血小板减少使得并发症风险高④分子方法：半乳甘露聚糖分子试验测试侵袭性曲霉病（FDA已经批准）ScottE.EvansandDavidE.Ost,Pneumoniaintheneutropeniccancerpatient,Infectiousdiseases,2015,21(3):261-27136日均痰标本与BAL送检对比36010203040506