聚合酶链反应

PolymerasechainreactionPCR聚合酶链反应河南科技大学医学院生物化学与分子生物学教研室第一节PCR的基本原理和影响因素PCR又称基因扩增技术。模仿体内DNA复制的过程，根据DNA变性、复性的原理在体外有目的的实施DNA的合成。在短时间内将极微量的目的基因进行成百万的放大。1.特点：周期短、特异性强、灵敏度高、操作简单、快速(效率高)等2.目的：对目的基因进行分析、鉴定（目的基因：是指我们所要研究或应用的基因）3.主要用途：目的基因的克隆、传染病和遗传病的诊断、法医鉴定等。一、概念原理依据DNA的变性与复性，以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板3端互补的寡聚核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制合成新的DNA片段。二、引物设计原则1、长度：引物的特异性取决与引物的长度、退火温度。一般为15~30个核苷酸。长度增加：能提高特异性，但退火时被引发的模板减少，效率降低。可提高退火温度，但会使延伸温度超过74℃。长度太短：特异性降低,出现非特异性片段。2、均衡碱基分布：GC含量一般在40％~60％，随机分布，3末端应避免C+G堆积现象，防止碱基错误配对。3、引物自身：不应存在互补序列，否则其会折叠成发夹状结构或使其本身复性。自身连续互补碱基不能大于3bp。4.避免引物间的互补：形成引物二聚体。结果图示5.引物的3：是PCR延伸的起始端，与模板应严格配对，避免自身配对形成二级结构，应小于3个互补碱基对。即3’端应选择G、C而不是A、T；现在认为5’端稳定3’端不稳定是好的引物，故应选Ａ、Ｔ而少选G和Ｃ。6.5末端仅限定产物的长度，对扩增特异性影响不大，可以加入酶切位点、进行点突变研究、设计简并引物。7.密码子的简并：引物3’端不要终止于密码子的第3位，因第三位易发生简并，影响扩增的特异性与效率。8.引物的特异性：引物在模板上的结合位点应该是唯一的，在非扩增部位不应再有结合位点的出现，通常引物与非特异性扩增序列的同源性不超过70%。9.避开产物的二级结构区。反应条件1.模板：含有目的基因的样品或待测样品2.引物：两段寡聚核苷酸(DNA)，约15~30个核苷酸，位于待扩增DNA区段的两侧，分别与模板DNA两条链的各一段(3端)序列互补。3.原料：四种dNTP。4.DNA聚合酶：耐热，TaqDNA聚合酶。5.Mg2+：DNA聚合酶的激活剂。553353引物引物模板模板三、典型PCR的反应步骤反应程序“变性-退火-延伸”三步曲，称为一个循环。即三个反应有序组合和循环，通常进行25~30个循环。1.变性：通过加热使双螺旋解链为单链DNA。90℃~96℃30s~5min(第一轮通常为5min)要使靶基因模板充分变性。2.退火：使温度快速下降(Tm-5℃)，促使引物与模板靶序列特异性结合。55℃(25℃~65℃)30s~2min3.延伸：在4种dNTP和Mg2+的存在下，TaqDNA聚合酶以引物为起始点，按5→3方向进行延伸合成。70℃~74℃30s~2min(最后一轮延长至10min)PCR过程结果检测电泳(凝胶电泳)同时选择合适分子量的标准DNA(maker)或阳性对照——定性或定量结果检测小鼠骨髓基因片段检测试剂盒组成(PCR试剂盒)小鼠骨髓基因片段检测试剂盒组成材料2×PCRMaster(基质液)DNA模板液琼脂糖阳性对照液上样缓冲液EB(溴化乙锭)数量140l100l0.5g60l(1300bp)200l100l管号1号管2号管3号管4号管5号管2×PCRMaster：10×Buffer(14l)、25mmol/LMgcl2(8.4l)、0.2mmol/LdNTP(2.8l)、引物(5.6l)、0.1U/lTaqDNA聚合酶(0.84l)、ddH2O(108.36l)操作1.样品处理2.PCR循环操作1.加样1号管中反应液：19l2号管中DNA模板液：1l混匀2.上机━PCR循环预变性94℃10min终延伸72℃5min保存12℃99min变性94℃1min退火50℃1.5min延伸72℃2min35次循环程序温度时间3.琼脂糖凝胶电泳(1)1%琼脂糖凝胶制备(2)倒胶制板(3)点样(4)电泳(5)结果观察3.琼脂糖凝胶电泳(1)1%琼脂糖凝胶制备取3号管中琼脂糖0.5g于三角瓶中，加1×TAE(Tris-acetateandEDTA)60ml，加热至琼脂糖完全溶化透明后，冷却至55℃左右，再加5lEB(10mg/ml)于琼脂糖溶液中，摇匀。(2)倒胶制板在模具中倒入琼脂糖凝胶，插入梳子，放置30~45min至凝固。小心取出梳子，将胶放入盛有1×TAE缓冲液的电泳槽中，注意梳孔应在负极边。(3)点样取5号管(上样缓冲液)2l和PCR产物6l混合，小心加入到梳孔中。另外，取8l阳性对照液加到另一梳孔中作对照。(4)电泳━120V电压(6V/cm)，60min。(5)结果观察━紫外灯照射下观察电泳情况。结果图示结果图示PCR产物PCR产物阳性–+二甲苯氰指示剂PCR产物引物二聚体溴酚兰指示剂紫外灯下二甲苯氰、溴酚兰无颜色，只有EB处显色注意事项注意事项①溴化乙锭有一定毒性。②循环仪类型的差异及循环温度的差异，可能导致引物二聚体(在兰色指示剂前面)的出现。③用过的枪头、离心管及时侵泡在1NHCL中。④点样时每个样品应换枪头或用双蒸水冲洗枪头。⑤电泳距离在2cm以上，且应有阳性对照，有利于观察。⑥防止PCR污染结果图示第二节PCR扩展技术一、反转录PCR二、mRNA差示PCR三、免疫PCR四、重组PCR五、原位PCR六、固着PCR七、不对称PCR结果图示第三节PCR的应用一、分子生物学领域1.引物的5’端修饰2.制备探针3.克隆4.直接测序结果图示二、临床医学领域1.病原体诊断2.遗传病的基因诊断3.免疫学及器官移植4.肿瘤5.法医学再见