胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究

胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究研究生：富亮指导教师：赵玉军教授徐福洲博士专业名称：预防兽医学研究方向：动物传染病学所在学院：畜牧兽医学院胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究第一章前言第二章apxⅠA基因的克隆与原核表达第三章apxⅠA表达蛋白的免疫原性研究猪传染性胸膜肺炎概况猪传染性胸膜肺炎（Porcinecontagiouspleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是24～25日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20％以上，最急性型可达80％～100％，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌概述胸膜肺炎放线杆菌（ActinobacilluspleuropneumoniaeAPP），属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型为辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide，NAD）依赖型，生物Ⅱ型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现15种血清型，1型-12型、15型属于生物Ⅰ型，13、14型属于生物Ⅱ型。APP菌体形态（G－）APP主要毒力因子溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）荚膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)转铁结合蛋白（Tbp）粘附素溶血外毒素（Apx毒素）APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repeatsinthestructuraltoxin，RTX），称为Apx（Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx），即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌ApxⅠ的血清型有1、5、9、10和11。毒素Ⅰ型的操纵子包括：毒素激活基因apxⅠC，毒素结构蛋白基因apxⅠA，两个分泌基因apxⅠB和apxⅠD，其中apxⅠC负责编码毒素激活蛋白，apxⅠA编码毒素结构蛋白，apxⅠB和apxⅠD与毒素的分泌有关。apxⅠA基因的N端疏水区是ApxⅠ的免疫原区，apxⅠA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。ApxⅡ毒素的表观分子量为103kDa～105kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。ApxⅡ具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。ApxⅢ毒素的表观分子量为120kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，ApxⅢ没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。ApxⅣ毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌ApxⅣ毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxⅣA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。不同Apx毒素的生物学特性Apx毒素类型溶血活性细胞毒性分子量（kDa）分泌的血清型ApxⅠ强强105-1101、5、9、10、11ApxⅡ弱中103-105除了10型以外ApxⅢ无强1202、3、4、6、8ApxⅣ弱弱200所有血清型Apx操纵子基本结构CABD毒素激活基因毒素结构蛋白基因毒素分泌基因胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆与原核表达技术路线：apxⅠA基因的克隆与测序重组表达质粒的构建与鉴定诱导表达诱导表达条件的优化PCR鉴定双酶切鉴定WesternBlotting不同时间不同IPTG浓度不同温度apxⅠA基因的扩增引物设计参照GenBank中apxⅠA核酸序列（D16582），应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引物中分别含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，预期扩增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。上游引物：AGCGAATTCATGGCTAACTCTCAGCTCG下游引物：AGCTCGAGATCCATTTGCTCCTCCATapxⅠA基因的PCR扩增结果PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示大小约为3.2kb，与预期大小一致。重组质粒pTA的PCR和酶切鉴定结果对重组质粒pTA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带；EcoRI和XhoI双酶切后切出大小分别为3.0kb和3.2kb的两条带，结果表明目的片段已克隆到质粒载体上。目的片段序列测定pTA的测序结果与GenBank中发表的APP标准10型apxⅠA基因（D16582）进行同源性分析，结果表明，两端的同源性分别为99.4%和99.6%。表明apxⅠA基因已经成功克隆到pGEM-Teasyvector克隆载体中。重组表达质粒pETA的PCR和酶切鉴定结果对重组质粒pETA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带；EcoRI和XhoI双酶切后出现5.9kb的空载体和3.2kb的插入片段两条带。鉴定结果表明目的片段以正确方向插入原核表达载体pET-32a中。不同时间诱导表达的SDS-PAGE电泳图含有重组质粒的BL21（DE3）经IPTG诱导后，可表达一相对分子量约120kDa的融合蛋白，与实际预测大小相符，不同诱导时间显示诱导后5～6h表达量最高。不同浓度IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图将不同IPTG浓度诱导的样品进行SDS-PAGE，结果表明，IPTG浓度为0.6mmol/L的蛋白表达量最高。不同温度IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图将不同温度诱导表达的样品进行SDS-PAGE，结果表明，在25℃条件下表达的蛋白表达量最高。重组质粒pETA表达产物Westernblotting检测结果表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用兔胸膜肺炎放线杆菌免疫血清作一抗，羊抗兔IgG作二抗进行免疫印迹检测。结果可见一条特异性的抗原抗体结合带，分子量大小与目的蛋白相同，从而证明表达的目的蛋白是apxⅠA蛋白。裂解后SDS-PAGE电泳图超声裂解后进行SDS-PAGE：经超声波裂解后离心，分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE。结果表明，目的蛋白在沉淀物中，故可判定目的蛋白以包涵体形式存在。apxⅠA表达蛋白的免疫原性研究技术路线：三种表达蛋白的纯化及Westernblotting分析天然ApxⅠ毒素蛋白的提取免疫原浓度的测定与免疫小鼠用间接ELISA方法检测免疫后小鼠的抗体水平APP1型菌和APP10型菌半数致死量（LD50）的确定与攻毒三种蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图纯化后的蛋白经过SDS-PAGE，结果如图所示，三种蛋白的大小分别为120kDa、58kDa、79kDa。纯化后比较显示杂带减少，表明纯化效果良好。三种蛋白的Westernblotting检测结果用APP10型菌免疫兔的阳性血清作一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作二抗，进行Westernblotting分析，结果如图所示，三种蛋白都与阳性血清反应，说明都具有免疫原性。APP10型菌所提取的天然ApxⅠ经过SDS-PAGE，如图所示，用饱和硫酸氨（（NH4）2SO4）沉淀法提取天然ApxI毒素蛋白的大小为105～110kDa。免疫原浓度的测定结果经BCATMProteinAssayKit测得apxⅠA表达蛋白浓度为2.5mg/ml、apxⅠAN表达蛋白浓度为3mg/ml、apxⅠAC表达蛋白浓度为2.4mg/ml、提纯的天然ApxⅠ毒素蛋白浓度为5mg/ml。实验动物分组组别小鼠数量第一组：天然ApxⅠ毒素蛋白免疫组12只第二组：apxⅠA表达蛋白免疫组12只第三组：apxⅠAN表达蛋白免疫组12只第四组：apxⅠAC表达蛋白免疫组12只第五组：空白对照组12只免疫程序与剂量将提取的天然ApxⅠ毒素蛋白和三种表达蛋白乳化后分别免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔两周。一免：将纯化的三种表达蛋白与提纯的天然ApxⅠ毒素用PBS稀释，与等量的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白100µg，进行多点皮下注射免疫。二免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白150µg，进行多点皮下注射免疫。三免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白200µg，进行多点皮下注射免疫。对照组用PBS与等量佐剂乳化后，对小鼠进行多点皮下注射免疫。小鼠免疫后的抗体效价020406080100120140第一组第二组第三组第四组第五组抗体效价（×1000）一免后效价二免后效价三免后效价APP10型半数致死量（LD50）的确定根据事先估计10型和1型的LD50，我们分别利用三个梯度的10型菌和1型菌对小鼠进行腹腔注射攻毒。APP10型菌小鼠腹腔攻毒结果攻毒浓度2×106CFU4×106CFU6×106CFU小鼠死亡数/总数1/63/64/6根据攻毒结果，我们确定APP10型菌的半数致死量（LD50）约为4×106CFU。注：分子为存活小鼠数;分母为试验小鼠数。APP1型半数致死量（LD50）的确定APP1型菌小鼠腹腔攻毒结果攻毒浓度8×105CFU1×106CFU2×106CFU小鼠死亡数/总数1/63/65/6注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。根据攻毒结果，我们确定APP1型菌的半数致死量（LD50）约为1×106CFU。攻毒结果第一组第二组第三组第四组对照组APP106/66/63/61/60/6APP14/63/62/60/60/6注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。三免十天后试验组和对照组分别用APP10型菌和APP1型菌5×LD50的剂量进行攻毒。24h内观察小鼠死亡情况及状态。结论1.本试验成功的从胸膜肺炎放线杆菌血清10型基因组DNA中扩增出了编码ApxⅠ毒素结构蛋白的apxⅠA基因，经克隆测序显示其长度为3158bp。与GenBank中发表的APP标准10型apxⅠA基因（D16582）进行同源性分析，结果表明同源性达到了99.4%以上。2.apxⅠA基因在原核表达载体pET-32a中进行了高效融合表达，表达产物分子量约为120kDa，最终确定的理想诱导表达条件为：诱导温度为25℃、IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h，且Westernblotting分析显示可与APP免疫血清发生免疫结合反应。3.纯化了apxⅠA、apxⅠAN和apxⅠAC三种表达蛋白，apxⅠA具有与天然ApxⅠ毒素类似的免疫原性，且N端免疫原性显著高于C端。4.提取了天然的ApxⅠ毒素蛋白，试验证明其具有免疫原性和交叉保护力。谢谢大家！