第九章 基因功能研究常用方法

第九章基因功能研究常用方法主讲教师：熊伟大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室弄清基因的生物学功能,才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能研究技术包括：（1）DNA克隆技术（2）转基因技术和核转移技术（动物克隆）（3）基因敲除技术（4）反义技术（5）RNA干涉技术第一节DNA克隆技术克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。也称基因克隆或重组DNA。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）工具酶•限制性核酸内切酶•DNA聚合酶Ⅰ•逆转录酶•T4DNA连接酶•碱性磷酸酶•末端转移酶•TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（三）目的基因•cDNA•基因组DNA目的基因①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准•能自主复制；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他二、重组DNA技术基本原理克隆基本过程目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章）（二）克隆载体的选择和构建若将外源基因连接到复制子(基因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接受体菌条件安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造）限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式转化转染感染（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录第二节转基因技术与核转移技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。•转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是“分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达”转基因动物构建过程•转基因载体的构建•将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞•将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中•对转基因动物进行鉴定转基因的技术方法•DNA显微注射法•克隆法•胚胎干细胞技术•逆转录病毒介导的基因转移•精子载体法等各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法转基因动物的鉴定•Southern杂交确定外源基因的整合以及整合的拷贝数•RT-PCR确定外源基因的转录和转录水平•Western杂交确定外源基因蛋白质的表达情况•实时PCR（荧光定量PCR）转基因技术的应用•（1）建立致病基因表达、调控的动物模型•（2）动植物新品种的培育•（3）各种基因工程产品的制备•（4）探讨生殖细胞的基因治疗方法囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体,为无性繁殖.1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件二、核转移技术克隆羊“多利”基因剔除技术也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。第三节、基因剔除技术基因剔除程序•将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚.•细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制①单基因决定疾病模型进行基因剔除以模拟基因失活.单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等②多基因决定疾病模型多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病第四节基因沉默技术基因沉默技术•反义(antisen)技术•RNA干涉(RNAInterference,RNAi)反义技术•反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子•反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译,其稳定性好,有广泛药用价值•核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表达RNA干涉(RNAi)•RNA干涉技术是利用体外合成的短双链RNA(21-23nt)抑制细胞内特定基因表达的技术,是转录后基因失活的一种研究基因功能的有力工具•机制:RNAi技术DicerRNAi技术siRNA5’3’5’3’InitiationStepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERKINASERdRPEffectorStep•siRNAbinding•siRNAunwinding•RISCactivationRNAi技术《医学分子生物学》课程作业根据自身专业和研究方向，以《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目，写一篇小综述。写作要求：1.按照一般发表文献的格式书写。2.可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相关文献，不得抄袭！3.字数：3000字左右。4.不得抄袭！论文格式•题目•摘要（Abstract)200字以内•正文前言正文问题与展望参考文献10-15篇•完成方式：手写稿或电子打印稿•完成日期：2012年12月15日前交到医学实验楼B-312或者下周上课课堂上交。疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五节克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定义从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式①利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；②根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。（二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作①遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析②分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆基因定位的基本方法•1.体细胞杂交法p283•2.原位杂交和荧光原位杂交•3.连锁分析体细胞杂交:•细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞(杂种细胞).•大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色体而人染色体逐渐丢失•仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色体上,就可找到某一基因座位原位杂交和荧光原位杂交(FISH):•根据疾病基因所编码蛋白质的信息,将其mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为探针从基因组DNA中钓取该蛋白质量的编码基因•如:用α及β珠蛋白基因的cDNA作探针,与各种不同的人/鼠杂种细胞进行原位杂交,找出cDNA探针与人染色体DNA的同源互补关系,从而将α及β珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上.连锁分析•原理:基因在染色体上成直线排列,不同基因相互连锁成连锁群,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或者遗传标记相连锁的特点进行定位•利用某个待定位的基因是否与某个遗传存在连锁关系,以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染