梅毒的实验室检查

L/O/G/O梅毒的实验室检查梅毒的定义梅毒是一种慢性传染性疾病。是由梅毒螺旋体（苍白螺旋体）引起，患病后病程漫长，早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，并生多种多样的症状和体征，病变几乎能累及全身各个脏器。病原体•为梅毒螺旋体，属于密螺旋体属，苍白密螺旋体苍白亚种(Treponemapallidumsubspeciespallidum)苍白亚种梅毒苍白螺旋体地方亚种地方性梅毒极细亚种雅司病密螺旋体属品他螺旋体品他病梅毒螺旋体的生物学特性1、直径0.10~0.15μm，有8~14个致密而规则的小螺旋，两端尖直。2、原生质圆柱体上紧绕着3~4根周浆鞭毛，故运动活跃，运动方式多样。3、G-，但不易着色。Fantana镀银染色呈棕褐色。4、在无活细胞的人工培养基中难培养，生长慢。5、抵抗力极弱，对温度和干燥特别敏感；对青霉素、四环素、红霉素等抗生素敏感。在干燥条件下不易生存。肥皂水和一般消毒剂以及加温42℃以上均极易将其杀灭。传播途径•性接触是主要的传染途径–未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性–随着病期的延长，传染性越来越小–到感染后2年，通过性接触一般无传染性•母婴传播–在妊娠7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘传染未经治疗者，虽已无性传播（病期2年），但妊娠时仍可传染给胎儿–病期越长，传染性越小;•输血传染•间接传播：日常用品、接吻、哺乳、医疗器械等途径（接触部位附有梅毒螺旋体）。免疫性•特异性抗体–感染2周后产生特异性IgM抗体,不能通过胎盘–感染4周后出现特异性IgG抗体,可通过胎盘•非特异性抗体–刺激机体产生抗心磷脂抗体/反应素–RPR和TRUST等方法可检出：5～7周或硬下疳后2～3周•完全治愈的早期梅毒可再感染梅毒的分期梅毒的诊断•梅毒的诊断–早期梅毒（一期、二期和早期隐性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隐性梅毒）–必须依靠病史、症状及实验检查进行综合分析•梅毒的实验室检查–结果对诊断有决定性意义常用梅毒实验室检测方法•病原学检测法：（1）暗视野显微镜检查（2）镀银染色检查•血清学检测法：非梅毒螺旋体抗原血清试验（1）VDRL(性病研究实验室试验)：需灭活（2）USR（不加热血清反应素试验）（3）RPR(加速血浆反应素环状卡片试验)（4）TRUST(甲苯胺红不加热血清试验)梅毒螺旋体抗原血清试验（1）FTA-ABS（2）TPPA/TPHA（3）TP-ELISA（4）发光法（5）胶体金法暗视野显微镜检查•标本类型：梅毒硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损的渗出液、淋巴结穿刺液•方法：暗视野显微镜下查找梅毒螺旋体。•结果：典型的梅毒螺旋体呈白色发光,其螺旋较密而均匀。运动方式：①伸缩其螺旋间距离而移动（主要方式）②蛇行式③旋转式•评价：①.简单、可靠。②.早期：硬下疳（梅毒血清学试验仍阴性）。③.阴性不能排出患梅毒的可能性暗视野显微镜下的梅毒螺旋体镀银染色检查•基本原理：梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染色，从而可以在镜下观察到梅毒螺旋体•结果：棕褐色的梅毒螺旋体病原学检查的临床意义•病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。•螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。•如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。非梅毒螺旋体抗原血清学试验•原理（抗心磷脂抗体）：–人体感染了梅毒螺旋体后，组织受到破坏，释放出来的一种类脂成分，与梅毒螺旋体结合形成完全抗原，刺激机体产生类脂质抗体（反应素）。–主要是IgM和IgG混合抗体。•抗体产生时间–感染3周-4周，硬下疳出现1周-2周–一般在感染后5～7周（或硬下疳出现后2～3周）产生。•抗体作用–无保护作用，治疗监测。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。梅毒自动旋转仪四种非特异性试验方法比较VDRLUSRRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、胆固醇同前+EDTA+氯化胆碱同前+EDTA+氯化胆碱+活性炭同前+EDTA+氯化胆碱+甲苯胺红抗原稳定性不稳定,1天稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月血清试验前处理需灭活不需灭活不需灭活不需灭活反应板及结果判断玻片，肉眼或显微镜玻片，肉眼或显微镜纸卡片，肉眼纸卡片，肉眼注释唯一用于检查脑脊液的试验，诊断神经梅毒结果容易判断结果容易判断一期敏感性（未经治疗）74%-87%77%-88%77%-99%77%-99%二期敏感性（未经治疗）100%100%100%100%晚期敏感性（未经治疗）98%99%98%99%检测流程（定性）①加样：–吸取50μl血清（浆）放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内。②加抗原：–将抗原轻轻摇匀，用试剂盒提供的针头加1滴抗原。③反应：–将卡片置梅毒自动旋转仪8分钟立即在亮光下观察结果。检测流程（定量）①稀释液准备：–在圈内加入50μl生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。②加样：–吸取50μl血清(浆)与各圈中盐水作系列稀释，并涂布满整个圈内。③重复定性试验后两步。凝集反应强度分级：3+～4+：圆圈内出现中到大的红色絮状物，液体清亮。2+：圆圈内出现小到大的红色絮状物，液体较清亮。1+：圆圈内出现小的红色絮状物，液体浑浊。—：圆圈内仅见红色集中于中央一点或均匀分散。RPR定量试验•中等至大的凝块为阳性（圈4和7）有明确但很小的凝块为弱阳性（圈2和3）颗粒均匀分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）为阴性临床意义•早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。–一期梅毒1年后转为阴性–二期梅毒2年后转为阴性。–晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性•早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。•经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。假阳性问题•假阳性：非梅毒患者的血清反应呈阳性①技术性假阳性–由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。②生物学假阳性–是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性急性生物学假阳性反应的疾病风疹水痘传染性单核细胞增多症传染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹慢性生物学假阳性反应的疾病•系统性红斑狼疮•自身免疫性溶血性贫血•盘状红斑狼疮•结节性多动脉炎•类风湿性关节炎•桥本氏甲状腺炎•风湿性心脏病•干燥综合征•毒品瘾者•慢性肾炎•肝硬化•老年•麻风(是唯一产生慢性生物学假阳性的感染性疾病)妊娠的假阳性反应这是一种生理情况下的生物学假阳性假阳性发生率较低有报告为0.4%，滴度低。假阳性问题•梅毒假阳性反应的处理–技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可除外。–对急性生物学假阳性反应，应做TPHA（TPPA）等试验进行排除。前带现象•原理–指二期梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果。•处理–将血清稀释后再进行试验。血清固定•耐血清性（血清固定）–指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。梅毒螺旋体抗体血清学试验：•检测血中特异性抗梅毒螺旋体特异蛋白为抗原的抗体（IgG和IgM）。•特异性IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出。实验方法•梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)•梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)•梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）•梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)•荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）•化学发光免疫分析法（CLIA）•梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPA/TPHA原理•TPPA试验原理与TPHA试验基本相同–TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒–TPHA试验中梅毒螺旋体致敏羊红细胞•特点–梅毒螺旋体(Nichols株)全抗原操作步骤1.试剂准备：试验前将试剂和待检标本恢复到室温。2.加稀释液：每份样本做4孔，加标本稀释液加至微量反应板孔内，第1孔100微升，第2～4孔各25微升。3.样本稀释：取血清25微升加至第1孔，混匀后取25微升至第2孔，混匀后取25微升至第3孔，混匀后取25微升至第4孔，混匀后弃去25微升。4.加对照液：第3孔加未致敏颗粒25微升，第4孔加致敏颗粒25微升。5.混合：将反应板置振荡器振荡30秒。6.反应：置有盖湿盒，孵育2h，或放4℃冰箱过夜观察结果。结果判断•1.观察加未致敏颗粒的第3孔，不出现凝集为有效试验。•2.观察凝集反应强度：分级如下。4+：颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠。3+：颗粒光滑覆盖大部分孔底。2+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环。1+：颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环。±：颗粒沉集孔底，中央形成一小点。一：颗粒紧密沉积孔底中央。荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）•原理–将有完整形态的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter螺旋体制备而成）吸收过的梅毒患者血清形成抗原抗体复合物，再加入异硫氰酸荧光素（FTIC）标记的抗人免疫球蛋白，与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成荧光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应。•曾经认为FTA-ABS试验是检测梅毒的“金标准”试验。TP-ELISA•原理–用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。•特点–本法可用于大规模血清检测。梅毒螺旋体抗体测定(ELISA法)结果的解读•阴性对照OD≤0.1，阳性对照OD＞0.8时实验正常，否则实验无效。计算方法：cut-off(co)值=0.12+阴性对照平均OD值，s/co值=病人OD值/cut-off(co)值，s/co值大于或等于1判为阳性，s/co值小于1判为阴性•注s/co值在0.5~2.0之间的灰区样本需复检确认后报告免疫层析临床应用•梅毒螺旋体试验的作用是作为证实试验•它们可以帮助确定非梅毒螺旋体试验阳性反应是真阳性还是假阳性。•一旦这些试验呈阳性，则患者终身阳性。方法特点•特异性强，敏感性高–很少出现假阳性。据统计，在普通人群中，有1%的生物学假阳性发生。①如系统性红斑狼疮患者血清可使FTA-ABS试验呈假阳性反应，但大多数病例中螺旋体呈串株状荧光。②传染性单核细胞增多症，可能由于嗜异性抗体所致，可使TPHA呈假阳性。③麻风患者也可使特异试验呈阳性。临床意义•作为RPR初筛阳性标本的确证试验。•不能作为疗效观察的指标。•阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合RPR结果进行诊断。假阳性问题•存在交叉反应的抗体•处理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反应的抗体。老年人抗体阳性的问题•1、真阳性•2、假阳性：这些老年患者所患的基础疾病可能使机体释放诱导产生抗类脂抗体和/或抗T.pallidum抗体的交叉抗原；梅毒检测流程图A1(ELISA)A1+A1-A2(PRP或TRUST）A1+A2+感染：既往或现在A1+A2-A3（TPPA）A1+A2-A3+可能是梅毒感染需结合临床表现A1+A2-A3-基本排除梅毒潜伏期美国2009年指南梅毒血清学试验结果的临床意义RPRTRUSTTPPATP-ELISA临床意义阴性阴性排除梅毒（一期梅毒的早早期）阳性阳性现症梅毒(梅毒孕妇所生的婴儿除外)阳性阴性生物学假阳性阴性阳性早期梅毒经治疗后（早期梅毒）RPR结果解释示意图治疗前治疗后早期一期二期早期潜伏晚期晚期潜伏三期阳性阴性TPPA结果解释示意图治疗前治疗后早期一期二期早期潜伏晚期晚期潜伏三期阳性阴性检测方法样品种类血清血浆末梢血脑脊液非梅毒螺旋体试验快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验(VDRL)