第三章 细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术显微镜和显微镜的分辨能力肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm0.61λ分辨率DN.sinα/2=λ:光源波长;α:物镜镜口角;N:介质折射率显微镜成像原理普通复式光学显微镜（lightmicroscope）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）（光程差或相位差转变为振幅差，相差板）荧光显微镜（fluorescencemicroscope）微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）（厚度差转变为明暗差；增加样品反差，立体感强）激光共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope）双目显微镜正置显微镜倒置显微镜荧光显微镜及其照片共聚焦显微镜及其显微图像激光共聚焦原理暗视野成像原理二、电子显微镜1，电镜基本知识和结构（波长小于0.1nm）2，样品制备（超薄切片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描）3，电镜种类扫描电子显微镜透射电子显微镜扫描隧道显微镜透射电镜及其图像扫描电镜及其图像第二节细胞组分的分析方法一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物差速离心密度梯度离心二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色DNA：福尔根（Feulgen）反应－－紫红色多糖类：PAS反应－－黄色脂肪：苏丹III－－红色蛋白质：米伦（Millon）－－红色三、特异抗体技术免疫荧光免疫电镜免疫沉淀Westernblotting四、特异核酸标记技术InsituhybridizationNorthernblot(RNA);Southernblot(DNA)原位杂交技术五、放射性标记技术六、定量细胞化学技术七、柱层析、分子筛、免疫吸附、免疫沉淀等方法分离蛋白质组分及复合物（交链和变性）定性、定位、半定量研究（标记，自显影）32P（14天）,14C（5760年）,3H（12年）,35S（87天）,131I（8）显微分光光度术（紫外显微分光光度、可见光显微分光光度染色）流式细胞仪流式细胞术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养1，植物细胞（原代细胞培养，永生细胞系）2，动物细胞（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）3，非细胞体系（DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等）细胞提取物，细胞核提取物植物组织培养动物细胞培养细胞的克隆二、细胞工程1，细胞融合与杂交植物细胞先去壁；融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失2，单克隆抗体技术三、显微操作技术1975年英国科学家MilsteinandKohler,1984年获诺贝尔奖B淋巴细胞+小鼠骨髓瘤转移细胞核、细胞器、基因等四、转基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等显微操作仪显微操作示意图单克隆抗体技术