Endostatin基因转染人脐带血CD34 造血干细胞的研究

Endostatin基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究江苏省肿瘤医院内科朱梁军冯继锋立项依据新生血管形成决定着肿瘤的生长、侵袭和转移，拮抗肿瘤新生血管形成是治疗肿瘤的有效途径之一。血管内皮抑制素(Endostatin)是近年来发现的一种新的强效血管生成抑制因子，它能特异性抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制肿瘤新生血管形成。人类造血干细胞是良好的基因转移靶细胞，来源广泛，取材方便，适用于体外培养，扩增量大，目的基因在体外易于导入。为探讨转染人Endostatin基因疗法对肿瘤生长的抑制作用，我们利用逆转录病毒载体将人Endostatin基因导入人脐带血CD34+造血干细胞中，并应用PCR及Westernbolt方法检测人Endostatin的转染和表达。材料质粒PLNCX-endo含有人Endostatin的全长cDNA，由第二军医大学南京军医学院徐根兴教授惠赠。包装细胞PA317、NIH3T3细胞由第二军医大学微生物教研室惠赠。限制性内切酶HindⅢ，ClaⅠ购自GIBCO公司，Endostatin单抗购自西安今迈生物工程公司，PCR试剂盒及PCR引物由上海生物工程公司合成。新生儿脐带血由南京市鼓楼医院妇产科提供。方法1、重组逆转录病毒载体扩增及鉴定：重组质粒PLNCX/Endo转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增；碱裂解法小量提取质粒经HindⅢ和ClaⅠ酶切鉴定。2、包装细胞PA317的转染及病毒液制备：用电穿孔法将25ug重组质粒DNA转入PA317细胞，孵育24小时后加入G418500μg/ml筛选，2周后抗性克隆开始出现，挑选克隆扩大培养，收集病毒上清，细胞株冻存。过滤并浓缩病毒上清液，-70℃保存备用。用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。方法3、CD34+干细胞的分离纯化：无菌选取顺产新生儿脐血，迅速置于盛有肝素抗凝液的储血袋中，密闭袋口备用。8小时内经Mini-MACS分离纯化，纯度达到90%以上。从1×108的界面细胞，平均可以分离获得（5～20）×105CD34+干细胞。4、将人脐带血CD34+细胞与生长因子IL-3（50ng/ml）、IL-6（50ng/ml）、和人干细胞因子（SCF50ng/ml）预培养48小时，8000r/min离心10min后收集细胞，然后重悬于收集的PLNCX/Endo病毒上清液中，与相同浓度的生长因子和无菌的Polyrane混合共同孵育，反复进行四次，用G418进行筛选，获得转染成功的CD34+细胞。方法5、转染细胞的检测:PCR检测Endostatin：选用PLNCX通用引物E15'-AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG-3'E25'-ACCTACAGGTGGGGTCTTTCATTCCC-3'提取CD34+/Endo和CD34+/PLNCX细胞基因组DNA，以其为模板，加入引物E1和E2，置50ulPCR扩增体系，按94℃5min,94℃1min，60℃1min，72℃1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，1.5%凝胶电泳分析产物。方法6、Westernblot:CD34+/Endo和CD34+/PLNCX细胞接种于6孔板，25×105个/孔，培养24h，用1ml无血清培养剂替换原培养液，继续培养48h，收集培养上清，浓缩50倍后行Westernblot印迹分析。方法7、统计学分析:实验数据以均数±标准差表示，比较采用团体ｔ检验。结果图1.经Mini-MACS分离纯化CD34+干细胞的FACS分析结果图2扩增质粒酶切鉴定1.HindⅢ单酶切2.ClaⅠ单酶切3.HindⅢ及ClaⅠ双酶切4.Mark←550bp重组逆转录病毒载体的扩增及鉴定：重组逆转录病毒载体经HindⅢ及ClaⅠ双酶切，行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在550bp处有特异性条带出现，说明逆转录病毒载体上存在人Endostatin基因结果图3.转染细胞PCR扩增表达1.Mark2.CD34+/endo细胞3.未转染质粒的CD34+细胞←382bp600bp→400bp→550bp→转染细胞的鉴定:CD34+/Endo和CD34+细胞基因组DNA行PCR检查示，仅CD34+/Endo细胞DNA中有550ｂｐ的特异性扩增条带结果图4转染细胞Endostatin蛋白表达1.CD34+细胞浓缩培养上清液2.CD34+/endo细胞浓缩培养上清3.蛋白质分子量图--14kd--24kd--20kd转染细胞蛋白表达鉴定：CD34+/endo细胞72ｈ浓缩培养上清用Endostatin单抗行Westernblot印迹分析,证实这一条带为Endostatin蛋白讨论Endostatin是1997年由美国哈佛大学医学院的O′Reilly等从小鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的培养上清中提取出的一种新的强效血管生成抑制因子。它由内生性胶原ⅩⅧ羧基端184个氨基酸残基构成，相对分子质量为20×103。体内外实验表明，Endostatin能特异性抑制血管内皮细胞增殖，对转移性肿瘤和原发性肿瘤的种植瘤均有显著的抑制作用且无明显毒副反应。NH2NH2N端中间部分C端EndostatinCollagenⅩⅧ的结构及Endostatin的位置讨论Endostatin作用的对象是基因组遗传相对稳定，很少发生突变的血管内皮细胞，所以Endostatin在用于肿瘤治疗时,可以避免长期应用后耐药现象的产生。目前Endostatin应用于临床治疗肿瘤还有较大困难，主要因为Endostatin缺乏天然折叠结构，是一个极不稳定的蛋白，其在体外活性极易丧失。应用基因工程技术，目前很难制备大量具有较高活性的蛋白。此外,Endostatin治疗肿瘤是一个长期过程，不但会给病人带来沉重的经济负担，反复注射治疗也给病人带来极大的不便。讨论近年来在干细胞支持下的大剂量化疗目前在临床上已得到广泛应用，在部分实体瘤的治疗中取得了十分理想的效果。目前研究表明，人类造血干细胞具有多种分化潜能，分化增殖能力强，可向不同的细胞系分化，因此可作为多种目的基因的靶细胞。造血干细胞来源广泛，取材方便，适用于体外培养，扩增量大，目的基因在体外易于导入。在细胞因子的剌激下，目的基因导入集落形成干/祖细胞的频率高达30%，甚至有报道达80%。造血干细胞生命周期长，体外培养可生存达3-4个月，有利于目的基因的长期表达。导入目的基因的人外周血造血干细胞经过体外扩增后可安全回植到体内或植入到组织配型相同的受体内并存活。讨论转基因疗法在理论上是一个较为可行和理想的选择。这样机体可自主产生高活性蛋白,不存在人工合成时经常出现的内毒素污染的问题，而且一次性治疗目的基因可在体内较长时间内稳定表达。目前已有一些在小鼠模型中成功应用病毒作为载体进行抗肿瘤血管形成的报道。在现有的多种基因转导方式中，逆转录病毒介导的基因转染为最常用。讨论由于逆转录病毒能整合到宿主细胞染色体中，因而目的基因能随宿主细胞分裂而遗传给子代，在宿主细胞中能获得长期稳定表达。在本实验中，我们应用逆转录病毒作为载体将人内抑素的基因导入人脐带血造血干细胞中。经PCR及Westernblot证实，转内抑素的人脐带血造血干细胞能稳定表达并分泌内抑素蛋白。本实验结果表明，逆转录病毒可以介导内抑素基因转染人脐带血CD34+造血干细胞并表达内抑素蛋白。这一结果为研究在干细胞移植支持下的大剂量化疗开辟了一条新的途径，为实体肿瘤的治疗提供了一种有效的手段。