天根RNA提取说明书

2)胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。d.细胞悬液：离心取细胞。每5×106-107动物细胞和植物细胞加入1mlTRNzol-A+。加入TRNzol-A+前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。e.血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积TRNzol-A+(推荐0.25ml全血加入0.75mlTRNzol-A+)，充分振荡混匀。2.将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：4℃12,000rpm(~13,400×g)离心10min，取上清。注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。4.每使用1mlTRNzol-A+加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2min。5.4℃12,000rpm(~13,400×g)离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新管中。(如果要分离DNA和蛋白质，可向天根公司索取提取方法)。6.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30min。7.4℃12,000rpm(~13,400×g)离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8.加入1ml75%乙醇（用RNase-FreeddH2O配制）洗涤沉淀。每使用1mlTRNzol-A+至少用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤。注意事项1．匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月。2．RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一个星期以上或-20℃一年。3．若提取细菌RNA，推荐应用RNApreppure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（目录号：DP430）。预防RNase污染，应注意以下几方面：1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2．使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染。3．RNA在TRNzol–A+试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用RNase-Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4．配制溶液应使用RNase-FreeddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，放置过夜，高压灭菌）。RNA提取操作步骤准备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-FreeddH2O、75%乙醇(用RNase-FreeddH2O配制)。1.样品处理a.植物组织：以叶片RNA提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在TRNzol–A+中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1min。大约100mg叶片使用1mlTRNzol–A+。b.动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50mg组织加入1mlTRNzol–A+，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRNzol–A+体积的10%。c.单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107）：可直接在培养容器中裂解（容器体积不超过10cm2）,或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。1)直接裂解法：直接在培养板中加入TRNzol–A+裂解细胞，每10cm2面积加入1mlTRNzol–A+。用取样器吹打几次。注意：TRNzol–A+加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果TRNzol–A+加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。Order:010-59822688Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。9.4℃5,000rpm(~2,300×g)离心3min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。10.室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可），根据实验需要，加入30-100μlRNase-FreeddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。不同组织或细胞RNA提取预期得率植物叶片100-200μg/g叶片动物组织6-10μg/mg肝脏组织动植物培养细胞5-10μg/106细胞血液3-5μg/ml人类全血问题指南低得率A．样品裂解或匀浆处理不彻底。B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。B．样品匀浆时加的试剂量太少。C．匀浆后样品未在室温放置5min。D．水相中混有有机相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A．组织取出后没有马上处理或冷冻。B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5℃--20℃，未在-60℃--70℃保存。C．细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。D．溶液或离心管未经RNase去除处理。E．电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。DNA污染A．样品匀浆时加的试剂体积太少。B．样品中含有组织溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液。蛋白和多糖污染A．样品中蛋白、多糖含量高。B．样品量太大。C．水相中混有有机相。版本号:DP121221产品内容目录号产品组成DP421100ml产品简介TRNzol-A+是天根公司最新研发的总RNA提取产品，具有更强的裂解能力，更高的灵敏度。可从细胞和组织中提取总RNA的试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRNzol-A+可保持RNA完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。TRNzol-A+试剂既可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）的总RNA提取，也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞）的总RNA提取，对动物、植物组织提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于NorthernBlot、DotBlot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。储存条件2-8℃避光保存12个月TRNzol-A+ReagentTRNzol-A+总RNA提取试剂目录号：DP421