乳酸菌胞外多糖的研究

第32卷第6期电子科技大学学报Vol.32No.62003年12月JournalofUESTofChinaDec.2003乳酸菌胞外多糖的研究李清春*1张景强2贺稚非3(1.电子科技大学中山学院广东中山528402;2.中山市中智医药有限公司广东中山528402;3.西南农业大学食品学院重庆北碚400716)【摘要】分析了产胞外多糖乳酸菌的种类，同型胞外多糖和异型胞外多糖的生物合成途径与遗传调控，以及影响发酵生产的因素。总结了乳酸菌胞外多糖的分离、纯化、纯度鉴定的方法及乳酸菌胞外多糖的重要结构单元与功能之间的相互关系。揭示出乳酸菌胞外多糖在食品、医药领域巨大的潜在应用价值。关键词乳酸菌;胞外多糖;生物合成;化学特性中图分类号Q939.9文献标识码AAdvanceinExopolySaccharideResearchbyLacticAcidBacteriumLiQingchun1ZhangJingqiang2HeZhifei3(1.ZhongshanCollege,UESTofChinaGuangdongZhongshan528402;2.ZhongshanZhongzhiPharmacyCo.LtdGuangdongZhongshan528402;3.CollegeofFoodScienceSouthwestAgriculturalUniwersityChongqingBeibei400716)AbstractThispaperisaimedtoprovideanoverviewofthebiosynthesis,extractionandpurification,composition,physicalandchemicalproperties,foregroundanditsapplicationofexopolysaccharideproducedbylacticacidbacterium.Keywordslacticacidbacterium;exopolysaccharides;biosynthesis;chemicalproperties乳酸菌胞外多糖(ExopolySaccharides，EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖,它们都是微生物适应环境的产物。近几十年来，由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发，新的微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸菌是食品级工业生产菌，与其他菌相比安全性高，所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。但产量低，菌株稳定性差，仍是制约其大规模生产的主导因素。现在各国科学家试图用基因工程的手段构建高产菌株，但至今仍没成功。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制品特殊的质构和风味，起到安全的食品添加剂的作用[1]，它还有可能成为食品级多糖的一个良好来源而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及持水[2]。胞外多糖还具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域。1EPS的生物合成1.1产胞外多糖的乳酸菌按伯杰氏系统细菌学手册中的形态分类法，乳酸菌分为18个属[3]，目前对乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属的胞外多糖研究较多。其中20世纪40年代开发出的由肠膜明串珠菌产生的右旋糖酐是最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是FDA批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖。2003年9月1日收稿*女28岁硕士主要从事食品微生物及发酵工程方面的研究电子技术论坛第6期李清春等:乳酸菌胞外多糖的研究765合成EPS的乳酸菌主要从发酵乳制品及发酵肉制品中分离得到。对600株乳酸菌进行研究筛选出30株产EPS的乳酸菌。对近20年来的研究结果的分析表明，不同乳酸菌的EPS生物合成量是不同的，结果如表1所示。此外，瑞士乳杆菌、嗜热链球菌嗜酸乳杆菌、肠膜明串珠菌、片球菌属也可产胞外多糖。表1不同乳酸菌EPS的合成量[4]乳酸菌合成量/mg⋅L-1菌种来源乳酸乳球菌80~600发酵乳制品ⅦⅥ开菲尔粒300~400开菲尔制品干酪乳杆菌488发酵乳制品德氏保加利亚乳杆354酸奶清酒乳杆菌1375香肠唾液链球菌嗜热亚种114香肠乳酸乳球菌乳脂亚种500香肠1.2EPS的生物合成及其遗传调控1.2.1EPS的生物合成微生物胞外多糖的生物合成因菌种不同而发生在生长的不同阶段和环境条件下。按合成位点和合成模式的不同，微生物胞外多糖的合成分为位于细胞壁外的同型多糖的合成与位于细胞膜上的异型多糖的合成。同型多糖的合成为不依赖C55-lipid-pp的合成模式，异型多糖的合成则为依赖C55-lipid-pp的合成模式。1)同型多糖的合成同型多糖，如由肠膜明串珠菌生产的葡聚糖，是在胞外合成的，合成体系包含糖基供体(蔗糖)、糖基受体及葡聚糖蔗糖酶(E.C.2.4.1.5)。在葡聚糖的合成中需解决的问题包括：单链或多链反应、启动子、主链延长方向、链的终止、受体机制及支链连接方式等。葡聚糖的合成属单链反应机制，葡聚糖蔗糖酶是一个糖苷转移酶(蔗糖-6-葡萄糖基转移酶)，它将供体(如蔗糖)的糖苷基团转移到受体即正在延长的葡聚糖主链上，蔗糖可启动其自身的多聚化反应，并不需要葡萄糖作为启动子。葡聚糖的合成特点是以蔗糖为唯一底物，合成所需的能量来自蔗糖的水解而不是糖基核苷酸，不需脂载体和独立的分支酶，产物分子量大。2)异源多糖的合成异源多糖是在细胞膜上合成的，它的合成体系包括糖-核苷酸、酰基供体、脂中间体、酶系统及糖基受体五个因子[3]。在细胞膜上合成多糖需要的活性前体即各种高能态的单糖，这些高能态的单糖主要是糖基-二核苷酸，所有含葡萄糖的多聚物(除糖原外)均以UDP-D-葡萄糖为供体；乙酸、丙酮酸、3-羟基丁酸等的活性形式是酰基，为胞外多糖的合成所必需；异戊二烯脂中间体整合多糖的重复单元，在原核细胞多糖合成中起作用的是焦磷酸异戊二烯脂；酶系统包括己糖激酶、糖基-核苷酸合成及转移酶、糖基转移酶、聚合酶等。异源多糖的合成始于EPS前体(糖核苷酸)的胞内合成，之后糖核苷酸在液态载体中形成重复的单元，最后一步将重复单元从细胞膜运输到细胞外，使之聚合成几百到几千个重复的单元，形成EPS。乳酸链球菌产EPS途径如图1所示。1.2.2EPS合成的遗传调控对大肠杆菌的研究表明，控制胞外多糖合成的基因蔟有三个功能片段如图2所示。图中区1的功能是将完整的多糖运至细胞表面，其突变子表现为多糖在细胞内聚集；区2的功能与糖基-核苷酸合成的专一性酶有关如转移酶和聚合酶，其突变子表现为不能产胞外多糖；区3的功能与多糖达到细胞表面后胞外多糖的修饰有关。区1和区3的突变子妨碍了多糖在细胞表面的表达，但不能抑制聚合物合成的酶系。对乳酸菌胞外多糖的生物合成的基因调控研究表明，嗜温乳酸菌产胞外多糖的特性受大小不一的各种质粒的控制，某些条件下(如高温、频繁传代)产胞外多糖的特性容易丢失。乳酸乳球菌乳脂亚种MS产胞外多糖特性受一个18.5-Mda的质粒的控制，该质粒还具有抗噬菌体的特性；干酪乳杆菌干酪亚种产胞外多糖的特性受一个4.5-Mda的质粒的控制；产胞外多糖的德氏乳杆菌保加利亚亚种不含质粒；乳酸链球菌NIZOB40产胞外多糖的特性受一个40kb的质粒的控制。文献[5]发现充分表达fbp基因，以果糖为碳源时，EPS的产量提高，证明FBPase(二磷酸果糖激酶)的低活性限制了EPS的合成。电子技术论坛电子科技大学学报第32卷766葡萄糖果糖葡萄糖-6-P葡萄糖-6-PdTDP-葡萄糖dTDP-鼠李糖478UDP-葡萄糖5623119110UDP-半乳糖酵解糖果糖-1,6-2p果糖-1-P果糖-1-P果糖-6-P重复单元epsDEFGHepsABCIKEPS1.甘露糖PEPPTS；2.磷酸葡萄糖异构酶；3.6-磷酸果糖激酶；4.α-葡糖磷酸变位酶；5.UDP-葡糖焦磷酸化酶；6.UDP-半乳糖-4-差向酶；7.脱氧-TDP-葡萄糖焦磷酸化酶；8.脱氧-鼠李糖合成酶系；9.果糖PEPPTS；10.1-磷酸果糖激酶；11.1,6-二磷酸果糖激酶图1乳酸链球菌产EPS途径基因蔟17kb区19kb区25kb区32.5kb聚合物转运后聚合核苷酸合成糖转移酶聚合酶图2控制大肠杆菌(E.coli)胞外多糖合成的基因1.3乳酸菌胞外多糖的发酵生产右旋糖酐是最早商业化生产的乳酸菌胞外多糖。美国农业部北部地区研究室(NRRL)开发的肠膜明串珠菌NRRLB-512是右旋糖酐工业生产的代表菌株，中国医学院输血及血液学研究所筛选的肠膜明串珠菌1226已在20世纪60年代推广使用。右旋糖酐的生产方法已趋于成熟，其他乳酸菌胞外多糖的发酵生产条件因菌种不同而存在一定差异。乳酸菌EPS的生物合成过程中糖的种类和含量对多糖的合成量有影响，德氏保加利亚乳杆菌存在时，EPS中乳糖含量升高。干酪乳杆菌CG11产胞外多糖的最佳碳源为葡萄糖。对唾液链球菌嗜热亚种发酵生产EPS发现，糖源为乳糖时EPS生成量最大。多数研究结果证实乳酸菌以10～20g/L葡萄糖为碳源可得到最高的胞外多糖产量。用响应面法优化半限制培养基上德氏乳杆菌保加利亚亚种RR产胞外多糖的条件，结果表明，该菌产胞外多糖的最适温度为38℃，在其生长的最适温度(37℃～40℃)内，最适pH值为5.0，氮源的最适浓度为30g/L,胞外多糖的最高产量达354mg/L。文献[6]报道唾液链球菌嗜热亚种LCX2001在最适温度47℃时产胞外多糖的能力下降，其最适条件为35℃，初始pH值6.5，发酵时间20h。一般好气产胶菌在限制氮源的条件下可增加胞外多糖的产量，但德氏乳杆菌保加利亚亚种除外，其产胞外多糖的氮源为其生长所需氮源的三倍[7]。在较低的温度下，细胞生长慢，细胞壁的合成也慢，从而使较多的磷酸类异戊二烯用于胞外多糖的合成，嗜温乳酸菌的研究支持这个假说。好气产胶菌(如野油菜黄单胞菌、少动鞘脂单胞菌等)也有类似表现。异戊二烯脂的运载活性在pH值6.5~7.0，pH值的降低将使胞外多糖的合成因失去脂中间体而受阻，但绝大多数乳酸菌产胞外多糖的最适pH值低于上述值。电子技术论坛第6期李清春等:乳酸菌胞外多糖的研究767从现有研究结果可以得到如下结论：1)当发酵温度低于最适生长温度时，有利于EPS的生物合成；2)培养基在酸性环境下，接近于中性的初始pH值，EPS合成量最大；3)糖和盐的种类和含量对EPS有影响，不同乳酸菌要求不一样；4)适当控制氮源有利于EPS的生物合成。2EPS的分离纯化EPS的分离纯化的目的是分离浓缩发酵液得到稳定的、易使用的、容易再溶的多糖产品。它必须达到纯化产品、除去杂质，停止或破坏由酶或组分产生的颜色和异味的副反应。EPS的分离纯化一般包括分离、纯化和纯度鉴定三个步骤。2.1EPS的分离乳酸菌EPS的分离常采用有机溶剂沉淀法。常用的溶剂有小分子醇类如甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮，它们可降低多糖的溶解，有助于脱色及脱去无用的低分子量物质。异丙醇是FDA认可的适用于食品级多糖提取的最佳沉淀剂。异丙醇的最佳用量为45％～60％，在发酵液中加入KCl等盐类能中和多糖分子的表面电荷，促进其在醇溶剂中的沉淀，减少醇类的用量。低分子量醇类可满足大多数多糖的沉淀。乙醇的用量一般为提取液的2～3倍。为节约有机溶剂的用量，常对提取液减压浓缩后再进行沉淀。经有机溶剂沉淀获得的EPS中，还含有无机盐、有机溶剂等不溶的一些低分子量有机物、大分子蛋白质等杂质，所以分离所得物只能称为粗多糖。2.2EPS的纯化纯化是指除去粗多糖中的杂质而获得单一多糖组分的过程。纯化首先是将多糖中的非多糖组分除去。一般