第2章产酶微生物

第二章产酶微生物的分离和选育产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物的分离和筛选原生质体融合育种基因工程育种产酶微生物主要讲授内容产酶微生物的分离和选育产酶微生物的分离和选育适应能力强生长周期短，培养简单，易于调控易突变，可诱变育种，基因工程育种种类繁多，产酶多样化微生物产酶的优势第一节产酶微生物目前投入工业发酵生产的酶约有50-60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。一、细菌1.大肠杆菌大肠杆菌（Escherichiacoli）细胞有的呈杆状，有的近似球状，大小为0.5µm×1～3µm，一般无荚膜，无芽孢，革兰氏染色阴性，运动或不运动，运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色，光滑闪光，扩展。•Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。•大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。•应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖；大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌；工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。•2.枯草杆菌•枯草杆菌（Bacillussubtilis）是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状，大小为0．7～0.8µm×2～3µm，单个细胞，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。芽孢0.6～0.9µm×1～1.5µm，椭圆至柱状。菌落粗糙，不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色。•枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，可以用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶等。•例如，枯草杆菌BF7658是国内用于生产α-淀粉酶的主要菌株；•枯草杆菌AS1．398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶；•枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶，而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。•放线菌（actmomycetes）是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌（Streptomyces）。•链霉菌菌落呈放射状，具有分支的菌丝体，菌丝直径0.2～1.2μm，革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。•链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物，同时还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。•此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可用于甾体转化。•三、霉菌•霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。•应用：•1.是制酱、酿酒、制醋的主要菌种；•2.是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种；•3.生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）；•4.农业上用作生产糖化饲料的菌种。•1.黑曲霉•黑曲霉（Aspergillusniger）是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。•黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。黑曲霉黑曲霉（可引起烧伤病人皮肤感染或真菌性肺部感染）青霉木霉•四、酵母•1．啤酒酵母•啤酒酵母（Saccharomycescerevis）是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞三形、卵形、椭圆形或腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有1～4个圆形光亮的子囊孢子。•啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。•2．假丝酵母•假丝酵母（Canndida）的细胞圆形，卵形或长形。能形成假菌丝、不产生子囊孢子的酵母。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。•假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的17-羟化酶，可以用于甾体转化。产酶微生物工业化要求非致病菌,不产生毒素最好是分泌型的胞外酶菌株稳定,不易退化和感染噬菌体产酶量高，酶性质符合要求产酶微生物的分离和选育产酶微生物原料廉价,发酵周期短,易培养提取1977年，联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的食品添加剂专家联合委员会（JEFA）就有关酶的生产应用安全问题提出了如下意见：一是凡从动植物可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶，可作为食品对待，无须进行毒物学的研究，而只需建立有关酶化学与微生物学的详细说明即可。二是凡由非致病的一般食品污染微生物所提取的酶，需作短期毒性实验。三是由非常见微生物制取的酶，应作广泛的毒性实验，包括慢性中毒实验。产酶微生物的安全性酶制剂申请资料酶制剂组成酶制备方法酶及微生物的毒理数据酶及其来源微生物的描述产酶微生物的分离和选育产酶微生物培养基组成生产设备发酵条件单一或复合酶杂质（生产中产生的）分析组分和杂质浓度的方法非致病性不产生毒素不产生抗生素产酶微生物来源空气水体极端环境土壤产酶微生物的分离和选育产酶微生物具体步骤产酶微生物的分离分离和筛选分离富集培养初筛样品的采集复筛土壤微生物•通风好，耕作土壤：细菌、放线菌多•通风差，多动植物残体：酵母、霉菌•中性、微碱性土壤：细菌、放线菌多•偏酸性土壤：酵母、霉菌一般，表层土除去，挖取5～20cm土壤，选3~5点，灭菌纸袋中，标明地点、日期、土壤性质、pH、植被情况等。返回富集培养•添加特殊的营养物质•调整培养基的酸碱性•控制培养温度和热处理•添加抑制剂返回分离•平板法：30-50菌落•各种不同培养基的选择•抑制剂的添加•培养条件的选择：温度、pH、盐度等返回初筛蛋白酶淀粉酶脂肪酶返回复筛•选用几种有代表性的培养基，在预定的几种培养条件下，对每个菌株进行培养，测定产酶能力。•培养条件的选择：温度、通气量等。返回优良菌种应具备的特征•选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广，转化率高；2.产物方面：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4.设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。一、自发突变与育种1、生产选育：富于实际经验并且善于细致观察的人们在日常生产过程中，发现自然突变，选育优良菌株。2、定向培育：用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。过程十分缓慢，“守株待兔”。产酶微生物的选育（一）诱变育种中的几个原则指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。2个主要环节：诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。二、诱变育种（1）出发菌株（originalstrain）出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。•具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、标记明显等）；•对诱变剂敏感•野生型菌株；•从生产中选育的自发突变菌株；•诱变获得的高产菌株出发菌株的选择标准：出发菌株的来源：（2）菌悬液的制备1.选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）2.同步培养（生理状态一致）3.菌龄：对诱变剂最敏感时期营养细胞：对数期孢子或芽孢：萌发前期4.菌悬液的制备方法物理诱变：生理盐水配制化学诱变：缓冲液配制5.菌悬液的浓度酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL细菌，放线菌孢子：108个/mL（3）诱变剂的选择及处理方法1.诱变剂的选择（高效，简便）物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂2.剂量的选择突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量,反而会使突变率下降。正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为70~75%,甚至30~70%的剂量。UV的剂量:固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异向正突变范围移动的剂量。常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）3.诱变处理方法单因素处理或多因素的复合处理：①同一诱变剂的重复使用；②两种或多种诱变剂的先后使用；③两种或多种诱变剂的同时使用.（4）中间培养（CM，培养过夜）目的：克服表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.分离性延迟：突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟：由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。分离性延迟的原因:对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。生理性延迟的原因:当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。生理性延迟:（5）突变株的筛选初筛复筛1.初筛（以量为主）（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性（2）根据平板颜色反应直接挑选透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）；抑菌圈法（抗生素）；变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）2.复筛（以质为主，定量测定）摇瓶培养，直接检测所需产物方法需简便、快速2步诱变育种的基本原则：•选择简便有效的诱变剂；•挑选优良的出发菌株；•处理单细胞或单孢子悬液；•选用最适的诱变剂量；•充分利用复合处理的协同效应；•利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；•设计高效筛选方案；•创造新型筛选方法。三、原生质体融合（protoplastfusion）1.定义：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。原生质体：在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细胞。原生质体融合育种的优势大幅度提高亲本之间重组频率扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，集中双亲本优良性状机会更大原生质体融合基本程序两亲本菌株的选择和遗传标记的制作（选择不同的营养缺陷型，（A:[a+b-],B:[a-b+]）对药物抗性差异）原生质体的制备（高渗条件）融合（PEG、离心沉淀、电脉冲等）融合子的检出（直接检出法和间接检出法）实用性菌株的筛选操作过程：亲本菌株的选择亲本：具有不同遗传背景的优质出发菌株，可以是野生型、诱变型（产量高，代谢快）。各自的优良性状突出有遗传标记遗传标记的选择•营养缺陷型标记：双亲带有不同的营养缺陷型标记•抗性标记：高温，高盐，抗药性•灭活标记：使细胞某些酶或代谢途径钝化•荧光染色标记•其它：孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素含量、利用的碳、氮源种类培养基的选择•完全培养基（Completemedium,CM）:可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的培养基。•基本培养基（Minimalmedium,MM）:仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。•补充培养基（Supplementalmedium,SM）:在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的培养基。(1)细菌细胞壁：主要成分是肽聚糖。溶菌酶→→肽聚糖N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的a-1，4键。酶系和酶浓度:根据细胞成分选择