上呼吸道病毒感染的诊断和管理

上呼吸道病毒感染的诊断和管理摘要急性呼吸道感染（艺术），是最常见的感染性疾病人，是一个重大的全球性的健康负担。病毒，最常引起一个温和的解决疾病，但发病率和高成本对社会而言，主要引起上呼吸道感染。70%的在瑞典的初级保健的感染是由于艺术。下呼吸道另一方面，感染是导致死亡的第三.在全世界，主要在儿童＜在资源贫乏的地区，5岁。区分病毒细菌可能很困难，常常导致抗生素的滥用。现代分子生物学为基础的诊断方法的病因诊断的可能性显著增加。本文旨在探讨多重实时PCR使用针对13种呼吸道病毒和细菌，从临床角度。本文对954例鼻咽样本，回顾性研究，PCR法，它是基于自动样品提取和复用放大，描述。检测率为48%。精简的测试成本限制（€每样33）随着高精度和快速的结果交货，是关键的成功实施广泛的分子检测。在一项前瞻性研究209成人原发性纸II评估者护理，和100无症状的对照组，症状持续时间的影响对检出率。总阳性率为43%的患者和2%对照组，患者＜6天显着较高的检测率症状持续时间（51%）相比，≥7天（30%，P＜0.01）。使用PCR检测显著减少抗生素的处方，在一项前瞻性研究（论文第三）的406名成人艺术。患者接受在48小时内造成的抗生素，4.5%（N=9，202），相比12.3%（n=25，204，P=0.005）在延迟组结果。在本文第四的诊断率，8753例患者的回顾性研究在连续36个月的年龄，明显高于冬季（54.7%）比在夏天（31.1%，P＜0.001），与儿童（61.5%）与成人相比（30.5%，P＜0.001）。鼻病毒是最常见的发现病毒（32.5%），独立的季节，表现出较高的遗传在季节变化。本文的研究结果支持类似的方法的实现常规的临床护理。关键词：呼吸道病毒，呼吸道感染，实时定量PCR，多重PCR，使用抗生素。列表中的文件本论文是基于以下的研究，文中提到的罗马数字。一、布里顿长R，诺德，罗盛中，威斯汀J，安德松L-M，林德M.多重实时PCR检测呼吸道感染。临床病毒学杂志41（2008）53–56II。布里顿长R，威斯汀J，罗盛中的林德，M，安德松l-m.前瞻性评估一种新的多重实时PCR检测十五呼吸检测病原菌–症状持续时间有显著影响检测率。临床病毒学杂志47（2010）263–267。三、布里顿长R，威斯汀J，罗盛中的林德，M，安德松l-m.的多重实时PCR方法的使用针对十三种病毒–影响抗生素在一项前瞻性研究的处方率。手稿。四、布里顿长R.安德松LM，林德M.威斯汀J.季节性变化的影响的诊断率多重PCR检测目标13呼吸。手稿。1引言呼吸道感染（RTI）是最常见的感染的所有人类。在死亡率方面，下生殖道感染是死亡的第三大原因在世界范围内，在所有类别和所有年龄组（1）。不过，孩子五岁以下，在低收入国家中最严重的这致命的疾病。急性呼吸道感染的发病率方面（ARTIS）仍占有相当大部分的保健访问甚至在中、高收入国家。在瑞典70%初级保健中的所有传染病的投诉由于艺术（2）和高达三分之一的所有的协商都是因为翻译（3）。这些感染主要是由细菌和病毒引起的，其中后者主要在上呼吸道。病毒却也常见的下呼吸道是表现在呼吸道感染的研究在英国的初级保健，检测63%例呼吸道病毒（4），和一些前瞻性研究对社区获得性肺炎（CAP）已检测到病毒作为第二常见病原菌后肺炎链球菌（5）。与艺术家的成本是惊人的。非流感病毒仅在美国艺术家，其对经济的影响已经被估计每年40000000000美元（6）。它可以是困难的临床上区分艺术造成的由病毒和细菌引起的，和分化是非常重要的因为治疗选择差异显著。的细菌感染呼吸道感染在某些情况下可以用抗生素治疗，这实际上可以拯救生命，但抗生素对病毒感染并无疗效。这LED在治疗抗生素的过度使用一个相当大的翻译（7）。急性支气管炎作为一个说明性的例子。急性支气管炎的治疗建议（这是由病毒引起的大多数情况下）在免疫功能正常的成年人不包括抗生素（8-10）。这是有效的在低收入国家，艾滋病高流行（11）。然而，抗生素对于急性诊断在高利率支气管炎。在英国的职业等人的研究，虽然病毒。在26%例急性支气管炎，63%例发现细菌，抗生素64%的患者（4）的规定。报告率在瑞典规定的用于支气管炎50%种抗生素已被报道（2），和美国59%（12）。不必要地使用抗生素具有重大意义，不仅对健康经济学，而且更重要的是对于细菌的发展电阻（13，14），以及从不良的病人事件如过敏反应和抗生素相关性腹泻（15，16）。现代分子诊断工具的发展和艺术，特别是病毒性的艺术家，如核酸扩增试验（NAATs，该术语包括任何试验直接检测的遗传物质感染器官）的可能性大大增加ARTIS的病因诊断。此外，这些测试已经促使新的病毒可导致人类呼吸系统疾病的发现，如人类偏肺病毒（HMPV）（17），SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）（18）和两个新的冠状病毒，冠状病毒NL63（cov-nl63）（19）（20）和CoV-HKU1。其他最近发现的病毒中发现的人类呼吸道，但到目前为止不确定的意义病原菌，是人类博卡病毒（HBoV）（21），多瘤病毒KI（病毒）（22）吴病毒（很喜欢）（23）。有越来越多的事实支持的人博卡病毒是人类的病原体，主要影响儿童和最常在与其他呼吸道病毒结合（24-26），但对病毒很喜欢在人类呼吸道疾病的因果关系的证据是低（27，28）通过这些高度敏感的方法检测未知病毒在一个成熟的协会代理和一个特定的疾病之间的结果，但因果关系往往更加困难。严格地说，科赫的假设1890认为制定；（1）代理人在任何情况下，本一种疾病，（2），疾病，它是具体的，（3）可以传播文化，和（4）可以接种到一个天真的主机引起相同的疾病，应采用。一个更现代的科赫的假设版本，其中有适用于病毒，建议由弗雷德里克斯和雷曼1996（29）和国家在短暂的：1。生物体是显着较高的检测患病率比对照组2。生物体引起疾病的动物模型，可以随后被检测到3。针对病毒的特异性免疫应答可以在主机检测一些问题仍然是：如果这些应用到证明因果关系的标准。例如，有可能是不合适的动物模型和结果感染可能取决于遗传背景不同的人，或前暴露于该病毒然而，该分子表征中发挥了至关重要的作用，严重的健康威胁，如SARS疫情快速反应措施2003和2009流感大流行。一种快速进行病因诊断提供适当的治疗选择病毒和细菌感染，一个更好的预测疾病的预后，在医院呆长或没有工作，学校或托儿所，和感染控制（30）。它已经表明，该或其他使用快速的诊断工具，用于检测呼吸道病毒，可能是一个减少不必要的抗生素处方药有用的工具（12，31，32）。然而，如果这些方法是可以实现的，适当的验证和多重实时PCR方法标准化是必须的。此外，流行病学和季节性分布的病毒导致人类呼吸道感染主要的，重要的是医生了解为了更好的诊断和管理这些感染。1.1诊断的实验室方法用于病毒呼吸道感染诊断在人类呼吸道病毒是基于四主要不同的方法，第一三检测到病毒或部分的病毒，和第四种方法检测诱导的免疫应答的被感染的个体：1。病毒分离2。抗原检测3。基因检测4。血清学1.1.1病毒分离在细胞培养病毒分离由诊断病毒学基础本学科的前期已为金标准其他方法进行了比较。该方法包括劳动强接种病人样本含有可疑的病毒在细胞培养（猴肾细胞和人成纤维细胞是常用的），这是易患的几种病毒。通常，几个细胞系是必要的。的致细胞病变作用（细胞肿胀或破坏），具体到每一个病毒，在细胞培养是公认的阳性样品。的一个优点是上呼吸道病毒感染的诊断和管理4一个活细胞株的获得，可进一步分析。过程比较缓慢，通常几天或几周前所需的结果可提供治疗的医生，因此往往太晚指导病人的治疗（33）。1.1.2抗原检测抗原检测方法，如酶联免疫吸附测定法（ELISA），是由第一次接种的表面上的病人样品进行了。表面可以是预涂有抗体捕获病毒抗原，或抗原直接吸附到表面。下一步涉及添加特定的酶标抗体，形成抗原抗体复合物。最后一种物质，这种酶可以转换成一个检测到的信号（通常是一个荧光信号）加入。利用单克隆抗体可以通过高度特异性。增加灵敏度的各种酶的增强步骤，所谓的酶免疫分析法（EIA）可以应用。在免疫荧光（IF）病毒蛋白不同的定位受感染细胞的部分增加的特异性。直接荧光抗体试验（DFA）使用的是荧光染料标记，抗体可用于快速抗原检测。流感和呼吸道合胞病毒试剂盒被广泛使用并具有快速床旁测试的优势，但缺乏的灵敏度比病毒分离及基因检测（34，35）。另一个优势抗原检测是可行的非病毒可分析，这可能是重要的样品时，需要一个很长的运输该实验室。1.3基因检测。核酸扩增试验对诊断有重要影响病毒和呼吸道病毒的检测，在灵敏度相当多的病毒，以前是很难增加与传统的方法证明可以在患者标本的检测。聚合酶链反应（PCR）方法是由Kary首先描述他在1983（36）和授予他诺贝尔化学奖1993。PCR是一种放大单个或几个拷贝的DNA到数以百万计的过程一个特定的DNA序列拷贝（从这一病毒）。方法依赖于反复加热和冷却的热循环，导致DNA熔化和酶复制。通常30-40周期进行了。DNA链作为下模板的每个新副本复制周期，在运动链反应设置，这在一个结果指数扩增。一个特定的热稳定聚合酶，如使用的PCR检测在本文的评价，是Taq聚合酶。它被隔离在1976嗜热菌Thermusaquaticus中（37），生长在温泉在70°C的温度，消除了需要添加新的酶PCR过程的每一个周期后，从而加快明显的。此外，病毒的基因组和DNA聚合酶，建筑块（寡核苷酸）和具体的搜索元素，所以称为引物，是DNA区域有针对性的补充，是必要的。缓冲溶液镁也要创造一种环境，是最重要的的聚合酶的工作。在简短的PCR方法包括以下步骤：1。从样品中提取的遗传物质2。RNA的互补DNA转化到（如果病毒是一种RNA病毒），通过逆转录酶3。重复扩增循环；A.变性的去sDNA（温度95°C）B.杂交/引物结合（温度58°C）C.伸长/聚合酶复制（温度70-80°C）病毒基因组检测自是特别容易，尽管他们的小的大小，它们都包含了一套完整的基因。尽管技术PCR已超过25年，这是在过去的10年里，方法得到了广泛的接受和使用在诊断呼吸道病毒感染。造成这种情况的原因有很多，但一些重要因素自动提取，缩短周转时间在实验室，减少成本，和多重PCR方法的发展，使在相同的几种病毒检测分析。实时荧光定量PCR（也叫实时定量PCR，定量PCR）指的是一个过程中核酸的检测可以连续测量作为PCR方法进行扩增循环，而不是注册检测毕竟20-40周期。这可以通过添加一个非特异性荧光结合到任何双链（DS）DNA（即PCR产物），比如SYBR绿色染料。一个与非特异性染色的缺点是：它绑定到所有的dsDNA和因此也可以绑定到不必要的序列如引物二聚体（一个的PCR潜在的副产品，由引物的分子有彼此杂交，并正在由聚合酶扩增，导致对PCR试剂竞争）。一个更具体的实时PCR方法通过与记者加入特定的寡核苷酸探针（或实现flourophore）和连接到探针的淬灭剂。结合的探针具体的序列，分析，并将不发出任何荧光只要记者和淬灭基团位于接近彼此接近。作为Taq聚合酶打破接近的记者和猝灭剂对探针，将它的目标，一个荧光信号可以被检测到，请参阅下面的图1。1.1.4血清学具有一定的生物感染可诊断测量抗体，由主机系统产生的对感染的反应代理。血清学筛查献血者仍然在起着重要的作用，病毒性肝炎或艾滋病感染的诊断，以及一个广泛的免疫试验代理范围。标本采集时间是很重要的，因为有足够的时间需要耗费产生抗体的免疫系统。检测对病毒抗原的IgM反应表明急性感染，但经常需要在IgG抗体明显升高证实。正常在免疫球蛋白增加4倍是必需的，这意味着至少有两个样品相隔1-2周或更多的要求。血清学试验是有限的在免疫功能低下的患者可能无法装入一个感染的体液免疫应答。血清学仍在支原体的诊断中起着重要的作用肺炎支原体肺炎，Chlamydophilia，即使限制血清学命名以上也适用于这些药物。基因检测，并在特别是实时PCR是诊断血清学替代M.肺炎杆菌，它已被建议，也许PCR结合和血清学诊断肺炎支原体是可选的方法（38）