胶原蛋白的提取1

本文由grearsky6贡献doc文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT，或下载源文件到本机查看。理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究目录英文缩写对照表………………………………………………………………………1中文摘要………………………………………………………………………………2英文摘要………………………………………………………………………………41前言…………………………………………………………………………………62材料…………………………………………………………………………………62.1主要仪器设备……………………………………………………………………62.2实验动物…………………………………………………………………………72.3样品与试剂………………………………………………………………………82.4常用工作液………………………………………………………………………83方法…………………………………………………………………………………93.1CPⅠ的制备………………………………………………………………………93.1.1粗提法…………………………………………………………………………93.1.2高效液相色谱分离纯化……………………………………………………103.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………103.2.137OC凝结试验………………………………………………………………113.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………113.2.3氨基酸组成和含量分析……………………………………………………113.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………113.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………123.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………123.2.7生物安全性实验……………………………………………………………133.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………143.3.1L929细胞的培养、冻存与复苏………………………………………………143.3.2UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………143.3.3CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………144结果………………………………………………………………………………164.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………164.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………161理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究4.2.137OC凝结试验………………………………………………………………164.2.2紫外吸收值测定……………………………………………………………164.2.3CPⅠ氨基酸组成和含量分析………………………………………………174.2.4蛋白质浓度测定……………………………………………………………184.2.5SDS-PAGE凝胶电泳…………………………………………………………194.2.6RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………194.2.7生物安全性试验……………………………………………………………204.3CPⅠ防止UVA氧化损伤实验…………………………………………………224.3.1UVA对L929细胞活性的影响………………………………………………224.3.2CPⅠ对细胞UVA氧化损伤的保护作用……………………………………225、讨论………………………………………………………………………………255.1CPⅠ的制备……………………………………………………………………255.1.1提高CPⅠ得率的因素………………………………………………………255.1.2提高CPⅠ纯度的因素………………………………………………………265.1.3高效液相色谱是分离纯化CPⅠ的有效途径………………………………275.2CPⅠ的理化性质鉴定…………………………………………………………275.2.1CPⅠ在223nm处有紫外最大吸收值………………………………………275.2.2CPⅠ氨基酸组成及含量分析………………………………………………275.2.3SDS-PAGE鉴定………………………………………………………………285.2.4RP-HPLC分析CPⅠ…………………………………………………………285.2.5CPⅠ具有生物安全性………………………………………………………285.3CPⅠ防止UVA氧化损伤研究…………………………………………………295.3.1UVA对成纤维细胞有活性有抑制作用……………………………………295.3.2CPⅠ能够降低UVA氧化损伤的细胞MDA活性…………………………305.3.3CPⅠ能够提高UVA氧化损伤细胞的GSH-px活性………………………30小结…………………………………………………………………………………31参考文献……………………………………………………………………………32文献综述胶原蛋白的研究进展…………………………………………………37致谢…………………………………………………………………………………462理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究英文缩写对照表英文缩写英文缩写CPⅠABPBddH2OPBS英文名称CollagenproteinⅠAbsorbanceBromophenolblueDoubledistilledwaterPhosphatebufferedsaline中文名称Ⅰ型胶原蛋白吸光值溴酚蓝双蒸水磷酸盐缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠三（羟甲基）氨基甲烷SDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDSTrisTEMEDDMSOCBBMTTSodiumdodecylsulfateTris(hydroxymethyl)aminomethaneN,N,N’N’-tetramethylethylenediamineN,N,N’N’-四甲基乙二胺DimethylsulphoxideCoomassieBrillantBlue3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide二甲基亚砜考马斯亮蓝噻唑蓝HPLCUVAMDAGSH-pxHighperformanceliquidchromatographyUltravioletradiationAMalondialdehydeGlutathioneperoxidase高效液相色谱长波紫外线丙二醛谷胱甘肽过氧化物酶3理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其型胶原蛋白的制备、抗UVA氧化损伤作用的初步研究学科专业：学科专业：动物学指导教师：指导教师：魏泓教授研究方向：研究方向：生化制药2001345）研究生：王琳（2001345）内容摘要本文围绕Ⅰ型胶原蛋白（CPⅠ）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的氧化损伤方面进行了初步探索，为CPⅠ的进一步研发提供理论基础和科学依据。以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CPⅠ的分离纯化。CPⅠ理化性质鉴定结果表明：样品在223nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS-PAGE测定CPⅠ由α、β、γ三条链组成；色谱分析纯度约为100%。通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CPⅠ进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于Ⅰ级，结果证明本方法制备的CPⅠ无毒副作用。评价CPⅠ对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。结果表明：随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。加入不同浓度的CPⅠ后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，其中50%CPⅠ组的效果极为显著（P﹤0.01）。提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯4理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究化CPⅠ，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。关键词：关键词：Ⅰ型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤5理学硕士学位论文：Ⅰ型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究Studiesonthepreparation，identificationofCPⅠandits，ⅠprotectiveeffectoncellsdamagedbyUVAMajor:BiologyTutor:Prof.WeiHongSpeciality:ZoologyAuthor:WangLin（2001345）AbstractInthispaper,howtoprepareCPⅠandidentifyphysico-chemicalpropertyhadbeenstudied,andUVAoxidativedamageL929wasperliminarydiscussed.Thesedatasprovidedtheoreticfoundationandscientificproofforfurtherresearchanddevelopmentofthisproduct.Pigskinwasusedasmaterial.Accordingtothecomparationamongthethreekindsofcrudeextractionmethodsincludingaciddissolve,enzymolysisandneutralsaltsolution.ThemethodofenzymolysiscombinedwithHPLCwaschosentoprepareCPⅠ.Thephysico-chemicalpropertyofCPⅠwasidentified.Theresultsshowedthat:CPⅠshowedcharacterabsorptionpeakat223nm;CPⅠhad18kindsofaminoacids,totalcountofaminoacidwasmorethan90%;theconcentrationofproteinwas1.03mg/ml;CPⅠwascomposedofαchain,βchainandγchainbySDS-PAGE;OnepurepeakwithHPLCwasfoundedanditspuritywas100%.ThesecurityofCPⅠaccordingtotheexperimentsofmiceaccutetoxicitywasevaluated,Guineapigsensitizationandcytotoxicityexperimentinintegerlevelandcelllevel.Itwasshowedthat:themicehadnotoxicreaction;theGuineapig’spointsofinjectionhadnoerythemaanddropsy;thecytotoxicitywaslowertha