血清酶类测定要点

血清酶类测定第一节概述血浆特异酶为血浆蛋白的固有成分，含量高于其他组织，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶原、ChE、Cp及LPL等。非血浆特异酶外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液，细胞内外浓度差异悬殊，当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。一、血清酶的来源二、血清酶变化的病理生理机制（一）细胞酶释放1、细胞内外酶浓度的差异：对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，因此只要有少量细胞坏死或者细胞有轻度病变，血中酶浓度就可能明显升高。2、酶在细胞内定位与存在形式：最容易释放入血的是胞质中游离的酶，而在细胞亚显微结构中的酶则较难溢出3、酶蛋白分子量的大小：酶的释放速度大致与酶的分子量成反比（二）血中酶的清除：一般以血中酶的半寿期来代表酶从血中清除快慢AST半寿期17±5hALT半寿期47±10h（三）酶合成异常：1、合成减少：2、合成增加：对于血浆特异酶，细胞内酶合成下降是引起血中酶变化的重要因素（1）癌细胞LD（2）骨骼疾病ALP（碱性磷酸酶）（3）前列腺癌ACP（酸性磷酸酶）（四）其他：测定值受抑制剂和活化剂影响三、血清酶的生理变异1.性别少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的来源组织有关。2.年龄血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。3.进食过量饮酒可使血清GGT明显升高。4.运动多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。5.妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。6.其他一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素有关。四、酶的区域化分布血清酶符号来源丙氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶肌酸激酶乳酸脱氢酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶-谷氨酰转移酶5-核苷酸酶单胺氧化酶-淀粉酶脂肪酶谷氨酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶胆碱酯酶山梨醇脱氢酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶ALTASTCKLDHALPACP-GT5-NTMAOAMSLPSGLDHICDCHESDHOCTLCAT肝、肾、心心、肝、骨骼肌骨骼肌、心、脑心、肾、骨骼肌、肝、肺小肠、胎盘、肝、肾前列腺、红细胞、血小板肝、胆、肾、小肠肝、胆道肝、肾、脑胰、唾液腺胰肝肝、胎盘、心肝肝肝肝五、酶活性测定在临床诊断中的应用（一）在诊断肝胆疾病中的应用反映肝细胞实质病变：ALT、AST反映肝细胞合成功能：ChE、LCAT反映胆道阻塞病变：ALP、GGT反映肝纤维化病变：MAO（二）在诊断急性心肌梗死中的应用CK-MB，LDH1，AST（三）在诊断急性胰腺炎中的应用ALP（四）在诊断骨骼疾病中的应用AMY，LPS（五）在诊断肌肉疾病中的应用AST，CK，LDH，ALD（六）在诊断前列腺疾病中的应用同工酶（七）在诊断肿瘤中的应用ACP第二节临床常用血清酶活性测定标本（血清或血浆）临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储存等一系列处理过程。而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。标本应避免溶血：大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多，少量血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7倍左右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。及时分离血清（血浆）：静脉采血后，必须在1-2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免血细胞中的酶通过细胞膜进入血清而引起误差。尽量用血清标本：大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。及时测定，如不能及时测定，应放入冰箱保存（但有些标本不能冷冻）•为防止酶蛋白变性，一般至少应在血清分离后的当天进行测定，否则应放冰箱冷藏•有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低温(特别是20℃冰冻)可引起不可逆性失活，反而不如室温稳定（“冷变性”）。氨基转移酶活性测定氨基转移酶又称转氨酶，在机体内多达60余种，广泛存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺、白细胞、红细胞中。其中以丙氨酸氨基转移酶(ALT或GPT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST或GOT)两种最为重要，它们催化机体内氨基酸的转氨基反应：ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸↔丙酮酸+L-谷氨酸ASTL-天门冬氨酸+α-酮戊二酸↔草酰乙酸+L-谷氨酸A-NH2+BA+B-NH2转氨酶[测定方法]一、速率法（连续监测法）原理NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min）计算ALT活性丙酮酸谷氨酸酮戊二酸丙氨酸LLLALTNADLHNADHLLD乳酸丙酮酸参考方法血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定1.该ALT测定法中存在两个消耗NADH的副反应评价双试剂法：血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5min，使样品中所含内源性α-酮酸（如丙酮酸）引起的副反应进行完毕。然后，加入α-酮戊二酸启动ALT的催化反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-△A／min)，计算出ALT活力单位。（ALT测定的首选方法）血清中存在的游离α-酮酸（如丙酮酸）和增多的谷氨酸脱氢酶（GLDH）能消耗NADH，使测定值偏高。2.在IFCC推荐的试剂盒中含有P5P，这是转氨酶的辅基，能使血清中ALT发挥最大活性。（二）定时比色法（两点法）国内采用的比色测定法有三种：赖氏法（30min）金氏法（60min）改良穆氏法（30min）三种方法的原理、试剂、操作步骤和酶作用温度都相似，单位定义和标准曲线绘制方法有差异。赖氏比色法原理：选择在500-520nm处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍必须降低底物α-酮戊二酸及2,4-二硝基苯肼的浓度ALT测定不是在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好的线性关系(这是赖氏法的最大缺陷)，其标准曲线不呈直线而为抛物线。2,4-二硝基苯肼丙酮酸苯腙(在碱性条件下呈红棕色)α-酮戊二酸苯腙(在碱性条件下呈红棕色)丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT37°pH7.4活性单位赖氏法以卡门单位报告测定结果卡门单位定义：血清1ml，反应液总体积3ml，25℃，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每分钟吸光度下降0.001A为一个单位（相当于每升反应体系中0.1608µmolNADH被氧化）。方法评价1.操作简便，不需要紫外分光光度计，易于普及，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。2.不适用自动分析仪；试剂稳定性差,底物缓冲液不易保存(易长菌);由于赖氏法必须降低底物α-酮戊二酸及2，4-二硝基苯肼的浓度，造成ALT测定不是在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好的线性关系，这是赖氏法的最大缺陷。[参考区间]赖氏比色法：5～25卡门单位（反应温度为37℃）速率法：男性：5～40U/L（反应温度为37℃，试剂不含P5P）女性：5～35U/L（反应温度为37℃，试剂不含P5P）ALT广泛分布于全身各组织器官，尤以肝细胞中含量最多，其次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时，细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入血，使血清中该酶活力显著增高。[临床意义](1)肝胆疾病：急性病毒性肝炎、慢性活动型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬变活动期、中毒性肝炎、胆结石、胆管炎和胆囊炎等。(2)心血管疾病：急性心肌梗死、急性心肌炎、急性心力衰竭、脑出血等。(3)骨骼肌疾病：多发性肌炎、进行性肌营养不良等。（4）一些药物和毒物可引起ALT活性升高：如氯丙嗪、异菸肼、苯巴比妥、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等ALT在肝脏疾病中的应用价值ALT急性明显升高，常达200U以上，病情较重者可达400-600U以上，甚至更高，个别重型病人甚至可超过1000U。ALT越高，肝脏细胞损害越严重。慢性活动性肝炎：ALT持续轻度升高几十或100U以上（100～200U）慢性肝炎急性肝炎重型肝炎•由于肝细胞发生大量变性，坏死，使ALT大量进入血液，因此，ALT迅速升高，高达数百～1000U以上，如果ALT含量越高，上升越快，说明肝细胞坏死严重，病情进展也越快。•当病情发展到一定的严重程度，肝细胞大量坏死，肝脏生产ALT的能力丧失，这时血液中的ALT降低，但是黄疸却持续升高（胆红素上升），这种现象即所谓“酶胆分离”，往往提示病情正在恶化，常是肝坏死征兆。ALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程度相一致。对ALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。肝硬化肝癌80%—90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALT是否增高主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALT维持正常，因为肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALT没有释放出来，因此，ALT没有升高，或ALT有轻度或中度增高。血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定[测定方法]一、速率法（连续监测法）草酰乙酸谷氨酸酮戊二酸门冬氨酸LLLASTNADLHNADHLMD苹果酸草酰乙酸NADH在340nm处有特征吸收峰，连续监测NADH消耗引起的340nm吸光度变化,根据340nm处吸光度下降速率（－△A/min）计算AST活性参考方法ASTL-天门冬氨酸+α-酮戊二酸↔草酰乙酸+L-谷氨酸自发↓脱羧丙酮酸（二）赖氏比色法[参考区间]赖氏比色法：8～28卡门单位（反应温度为37℃）速率法：8～40U/L（反应温度为37℃，试剂不含P5P）[临床意义]1.AST广泛分布于全身各组织器官，在心肌细胞内含量最多，当心肌梗死时，血清中AST活力增高，在发病后6～12h之内显著增高，在48h达到高峰，约在3～5d恢复正常。2.血清中的AST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清AST的升高，有时可达1200卡门单位，中毒性肝炎还可更高。3.肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清AST的轻度增高。AST/ALT比值大小有助于临床判断肝病严重程度急性肝炎的AST/ALT均值为0.56:1肝硬化的AST/ALT均值为1.13：1肝癌组AST/ALT均值为2.41：1急性肝坏死组AST/ALT均值为3.61：1肝细胞中的总含量：AST（主要存在于肝细胞线粒体内）＞ALT（主要存在于肝细胞胞浆内）肝细胞轻度损伤时主要是胞浆酶释放出来，血清中ALT＞AST；而肝细胞重度损伤时胞浆酶、线粒体酶均释放出来，血清中AST＞＞ALT；随着肝病由轻变重，AST/ALT的比值就由＜1变为＞1血清碱性磷酸酶（ALP）活性测定碱性磷酸酶(ALP或AKP)是一组底物特异性较低,在碱性条件下（最适pH为10左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。ALP广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼，主要用于诊断肝胆和骨骼疾病[测定方法]一、速率法原理以对-硝基苯酚磷酸钠（PNPP）为底物，AMP或二乙醇胺（DEA）为磷酸酰基的受体。在碱性条件下，ALP催化PNPP水解释放出磷酸基