艾滋病实验室检测技术进展(日照)

艾滋病实验室检测进展山东省疾病预防控制中心苏生利186152817722015年10月9日日照一、检测进展1、样本：全血、血清、血浆、唾液、尿液、滤纸干血斑2、筛查方法：酶标、快速、化学发光3、试剂：三代→四代4、确证方法：WB/RIBA5、病毒载量：定性、定量6、CD4：微球法、体积定量法7、新发感染：BED→亲和力•HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等：–以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。–以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。–以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。检测目的感染机制吸附→进入→转录→整合→基因表达→芽生集合→芽生→成熟“柏林病人”，世界上第一个被公认治愈的艾滋病病人（2009）gp120gp41Fiebig分级实验室检测指标感染时间Ⅰ级VL阳性，其他检测阴性5天以内Ⅱ级VL阳性，P24抗原阳性，其他检测阴性6－10天Ⅲ级抗体阳性，WB阴性11－13天Ⅳ级抗体阳性，WB不能确定14－19天Ⅴ级抗体阳性，WB阳性，WB检测没有P31条带20－89天Ⅵ级抗体阳性，WB阳性，P31条带阳性90天作为高危人群检测点，poolPCR阳性，p24抗原阳性，但四代ELISA、三代ELISA均阴性，召回时感染21天，三代ELISA阳性，确证试验结果不确定，感染41天检测确证试验阳性。3.50.340.77有一对MSM与网络上找到的一位MSM性伴接触之后约1周，相继出现急性期感冒症状，发烧，肌肉疼痛，乏力。高危行为后2周，到门诊检测。急性期病例第一检测点，仅poolPCR阳性，p24抗原、四代ELISA、三代ELISA均阴性，召回时感染22天，三、四代ELISA阳性，确证试验结果不确定，感染30天时确证试验阳性。Pool阳性，p24、四代筛查试验结果阴性0.851.610.751.42（一）样本（1）全血、血清、血浆、唾液、尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测。（2）抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴细胞测定。（3）血浆可用于HIV-1病毒载量、基因型及耐药检测。DBS样品可用于HIV-1基因型及耐药检测。（4）全血、血浆、淋巴细胞富集液、外周血淋巴细胞（PBMC）及DBS样品可用于HIV核酸的定性检测。（5）PBMC、全血、淋巴细胞富集液等可用于HIV-1分离培养。1、全血样本•采血管选择K2EDTA、K3EDTA抗凝管。•不建议使用肝素抗凝。临床中不使用肝素抗凝进行免疫学检测项目，可能对白细胞计数有影响。•全血用于CD4检测最好使血液达到试管的填充线处•确保保持正确的血液:抗凝剂比例•+/-10%填充量的差异是可接受的•当血液与EDTA-Na2抗凝剂的比例为1∶4以上时不影响.防凝血采集注意事项样本样本混匀•采集的静脉血注入抗凝管后，立即轻轻颠倒抗凝管6-8次，使血液与抗凝剂充分混合，防止血液凝固。样本标记•血样上应标记上姓名和编号，送检表上送检编号位置注明血样编号，并按顺序排列血样和送检表。样本标记•不建议姓名标记在外包装袋上，标记管上。正确包装送检单放置CD4送检问题-放冰块？•在室温（18-25℃）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37℃）。•高温季节，样本需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。送检单•送检表格填写应完整，不能空项。电子版表格年龄几年不更换样本送检流程•样本接收我中心卫检部，由1号楼西门进，登记后送至4楼。门铃。•CD4送检时间每周三8:30-11:30，下午1：30-2:30（CD4）•其他检测项目每天8:30-11:30，下午1：30-16:30（留半小时登记时间）请送样人员计划好自己的行程。2、血浆•采血管选择K2EDTA、K3EDTA抗凝管。•不建议使用肝素抗凝，因为肝素中阴离子能结合蛋白质，使蛋白质变性，是taq酶的强抑制剂。也就是说在PCR后续的实验中会抑制酶的作用。•分离血浆用于抗体和VL检测。要求：离心吸取白细胞层-80度冷冻，避免反复冻融。2014年10月收到丙肝检测样本3、血清•如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清。•血清用于抗体检测。•4℃保存一周。4、唾液注意：饭后-食物残渣刷牙、漱口后-被检测物含量低5、尿液•原则上留取早晨起床后第一次尿液的中段尿（晨尿），也可留取随机尿的中段尿。•注意：①女性患者月经期；②血尿标本；③乳糜尿等。6、干血斑•干血纸片法（DBS），即将全血样品收集在卡纸上。•它需求较少的血量，创伤小，方便血样采集、存储运输方便。•用于HIV核酸的定性检测及耐药检测。干血斑样本采集在HIV检测中的应用评估2015：凉山州确证实验室培训（二）检测技术-ELISA法初筛：高敏感性=真阳性率=a/a+c；复核：高特异性=真阴性率=d/b+d三代试剂↓阳性-Ab三、四代试剂阴性阳性发报告WB四代试剂↓阳性(Ab或Ag)三代试剂阴性阳性发报告WB检测模式四代试剂↓阳性(Ab或Ag)四代试剂阴性阳性发报告WB2、快速法•免疫层析实验•渗滤实验（双抗原夹心法）•三代~四代•批批检？阳性阴性2014年10月15日某市发现1例反应15分钟，结果阳性，颜色有点浅反应40分钟，结果阴性反应2小时，结果阳性，条带已干，只留下印迹示例快速检测注意问题1、血清质量影响结果～陈旧2、操作误差～SOP3、结果判定～2人判定、光线充足4、反应时间～定时5、试剂保存～常温、冷藏6、建议采集血清、浆检测7、记录与保存3、化学发光法同时检测抗体和抗原正常值参考的意义及灰色区域的存在如果测定结果处于灰色区域（约在正常值上下限以内20%）内，则需要进一步追踪检查。95%或99%-20%+20%在二位点夹心ELISA中，在剂量反应曲线的高剂量区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），这种现象称之为HOOK效应。传统方法受技术的局限可测范围较窄;化学发光对强阳性标本可避免出现阴性结果。可以降低钩镰效应(HOOK)引起的风险•化学发光检测使窗口期由43.6天缩短为38.3天，虽然只缩短了12.2%，但却将残余风险降低了46.4%。方法学窗口期（天）残余风险ELISA43.61/17501CLIA38.31/32637可以降低残余风险化学发光全自动检测•样本周转时间更快，29min•即来即做，不必等待批量标本•试剂机上保存，不需平衡试剂温度•避免手工操作中的多种干扰因素•减少低价值的重复性人工操作……试剂评估（2007年）•本次评估使用随机抽样方式抽取已知血清标本1556份，其中阳性标本501份，阴性标本为1055份。•科美东雅：灵敏度100%；特异度99.43%；准确度99.61%。•阿克苏：灵敏度100%；特异度99.15%；准确度99.42%•结论：科美东雅CLIA试剂HIV抗体初筛结果与生物梅里埃（Ag+Ab）ELISA试剂比较有较高的灵敏度、特异性。统计分析表明：二者准确度显著性检验无差异(u=0.7765，u＜1.96，P＞0.05)。•将第一次两种试剂检出的15份假阳性标本（科美东雅6份，生物梅里埃9份），分别进行重复检测，结果均阴性。二次结果汇总统计：两种试剂检测结果一致，符合率为100%。4、确证实验示例检测时间带型结论2013.09.12gp160gp120p66p51p31p24p17阳性2014.03.21gp160不确定2014.07.04gp160p24不确定2014.09.12gp160±不确定2014.12.11gp160p66p51p31p24阳性HIV抗体确证检测数据省份确证检测数阳性阴性不确定阳性百分比阴性百分比不确定百分比  北京市56833739855108965.815.019.2  天津市101167820612767.120.412.6  河北省175696864414455.136.78.2  山西省126799412514878.59.911.7  内蒙古7945161978165.024.810.2  辽宁省2717203737430675.013.811.3  吉林省932790727084.87.77.5  黑龙江省1669112128226667.216.915.9  上海市3743250569354566.918.514.6  江苏省3735339210723690.82.96.3  浙江省4528383035034884.67.77.7  安徽省2379154356826864.923.911.3  福建省2975217844135673.214.812.0  江西省2057167921716181.610.57.8  山东省2552192237525575.314.710.0  河南省4564394233928386.47.46.2  湖北省3408264742533677.712.59.9  湖南省4932412533647183.66.89.5  广东省1815151218611783.310.26.4  广西136131282328250894.22.13.7  海南省493416344384.46.98.7  重庆市6521573734244288.05.26.8  四川省20768183121203125388.25.86.0  贵州省3235270625227783.67.88.6  云南省148031348775256491.15.13.8  西藏8755221063.225.311.5  陕西省210616618336278.93.917.2  甘肃省6775101036475.315.29.5  青海省4322841123665.725.98.3  宁夏29225275.917.26.9  新疆1053924646587.76.16.2  建设兵团57513389.55.35.3全国1163919710610049923683.48.67.9HIV快速确证试剂•2013年4月，美国Bio-Rad公司宣布向美国以外的市场销售一种能在30分钟内完成确证检测的快速试剂（Geenius™HIV1/2ConfirmatorySystem，左图），美国已投入使用，尚未在中国注册。此类试剂如能在中国市场使用，可大大缩短确证检测时间，又可降低目前快速筛查试剂的假阳性率。该图为目前美国使用的快速确证试剂。该图为美国研发的更加类似于WB的多条带快速试剂，尚未获批。目前在巴西进行验证。国内尚无快速确证试剂研发的立项课题，有正在进行该项目探索研究的企业。5、尿液检测网络平台查询MSM人群艾滋病实验室现场发放/药店购买邮寄/自送结果尿液HIV-EIA试剂：96%-98%，特异性98%-100%。采尿管：采集尿液后，室温可保存4周。MSMNGO小组检测人员很兴奋很高兴影响考核指标怎麽办？安全方便多了个办法不知道是谁干嘛做？愿意接受安全可行错了谁承担责任？准吗？可靠吗？增加工作有何好处？多少钱？多少钱？可靠吗？哪里可以做？可带去干预场所吗？价格是多少？看结果方便吗？担心采别人尿不可能每天检测什麽时候能用？何时可以用？质控如何做？示范区UCT项目面对面调查6、可区分抗原抗体检测（快速检测试剂-四代）•该试剂可同时检测人血清、血浆、静脉或手指针刺全血中HIV-1p24抗原及HIV-1和HIV-2抗体，可区分急性HIV-1感染和已确诊HIV-1感染，但不能区分HIV-1抗体与HIV-2抗体，也不可用于献血者的筛选。四代HIV快检试剂酶联荧光分析法(ELFA)•人类免疫缺陷病毒抗原及抗体检测试剂(VLDASHIVDUOUltra)是在HIV-1p24抗原和抗HIV-1和抗HIV-2总免疫球蛋白的联合检测基础上，进行的一个自动检验，可以缩短血清转化时的窗口期。•VIDAS系统对每个抗体和抗原结果都进行