免疫磁珠技术

免疫磁珠技术（IMB）在食品有害微生物检测中的应用目录1免疫磁珠技术简介1.1免疫磁珠的结构与性质1.2免疫磁珠技术2免疫磁珠技术的应用2.1IMB技术在食品有害微生物检测中的应用2.2免疫磁珠与其它检测手段的联用2.3免疫磁珠技术在其他领域的应用2.4免疫磁珠技术的优缺点及发展方向1.免疫磁珠技术简介1.1免疫磁珠的结构与性质1.1.1免疫磁珠的结构免疫磁珠（IMB），也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子料，最外层是免疫配基。载体微球载体微球功能基高分子层磁性物质金属小颗粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖（淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同的物理性质。免疫配基免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。1.1.2免疫磁珠的性质由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性，从而可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，也可使生成的新复合物在磁场中具有相同的磁响应性，且行为一致磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非特异性结合顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，由此可方便地进行分离和磁性导向保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。1.2免疫磁珠技术免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原—抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的。基本原理：磁性微球经过一定处理后,可将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗体与特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。2.1食品有害微生物检测中的应用免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的优点，它能从样品中迅速、有选择性地分离出目的微生物，有效地减少了背景的干扰，提高了精准性。还能捕获受损伤的靶细菌，而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。目前，免疫磁珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物的检测。2.免疫磁珠技术的应用2.1.1大肠杆菌O157的检测传统分离E.coliO157∶H7所采用的直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coliO157∶H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准（GB/T4789.36-2008）和出入境检验检疫行业标准(SN/T1059.5-2006)。检样25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n），均质225mL免疫磁珠捕获涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落5个~10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSIMUG-LST阳性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕获法检测程序阴性血清学试验非O157细菌生化试验报告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h增菌免疫磁珠捕获与分离1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后，用开盖器打开每支Eppendorff管的盖子，每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠悬液。2.取mEC+n肉汤增菌培养物1mL，加人到Eppendorff管中，盖上盖子，然后轻微振荡10s。每个样品更换1支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，避免交叉污染。具体操作步骤3.结合:在18℃~30℃环境中，将上述Eppendorff管连同磁板架放在DynalMXl样品混合器上转动或用手轻微转10min，使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在Eppendorff管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到Eppendorff管中，并重复4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤4~6。7.重复上述步骤4~5。8.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。9.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板一侧，然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后，翻转平板，于36℃士10℃培养18h---24h。菌落识别在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色;在改CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。初步生化试验:在CT-SMAC和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上挑取5个~10个典型或可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，于36℃士1℃培养18h~24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36℃士1℃培养18h~24h，并进行鉴定。大肠杆菌O157的检测Fratamico等将兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗体连接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，从食物增菌培养液中分离O157∶H7菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，加入荧光素标记的O157∶H7抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体（IMB/IL）荧光试验方法，可在8h内快速检测出多种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出E.coliO157∶H7感染样本。2.1.2单核细胞增生李斯特菌的检测传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约5～14d，步骤繁琐且灵敏度低，而IMB技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中(SN/T0184.3-2008)。检样25g(mL)对225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL转种10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取50uL免疫磁珠悬液划线于CHROMagar显色培养基，OXA/PALCAM琼脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑选5个典型菌落接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养鉴定和确认试验单增李斯特菌的检测方法1样品制备2增菌3免疫磁珠分离((IMS）1)免疫捕获混增菌培养液.沉淀所有的粗糙食物残渣.从增菌培养液中移取1mL上层液体(要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒)加人Eppendorf管中.加20μL准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。2）分离将Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800轻缓摆动磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的Eppendorf管管盖,从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头;加1mI灭菌的PBS，并重新盖好盖子.将磁极从支架上移走，1800轻缓摆动磁架5次一6次,使管内各成分混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开.并加100μL灭菌的PBS到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器.，可以用手摇代替.4.分离培养1）分离培养吸取50μL免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任一选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上.用无菌接种环划线.35℃士1℃培养22h-48h。2）筛选李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色.且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长22h后菌落呈现黑色.直径为1mm.在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色.直径2mm--3mm.除在菌落周围有一环外.在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在()XA琼脂平板上菌落相似。在CHROMagar显色培养基及OXA或PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落.接种于TSA-YE琼脂平板上.纯培养后进鉴定。5.鉴定和确认单核细胞增生李斯特氏菌的检测Skjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中分离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴定，此法的敏感性为102～104cfu/mL样品。Hudson等研究表明，将免疫磁珠技术与PCR结合，24h内即可检出火腿中的单增李斯特菌。2.1.3沙门氏菌的检测例1：Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠分离、DNA提取及PCR扩增，12～13h即可完成检测过程，IMB-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。例2：Blackburn等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。此法的敏感性可达105cfu/g食物，总的检测时间从5d减少至1~2d。IMB技术的优点IMB技术适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，能快速有效富集食品基质中的目标病原菌，且有良好的灵敏度和特异性，检测限可达到1—10cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方法中的72小时检测周期缩短至40小时，而且能有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌的检测和鉴定提供了有效的快速筛选技术。2.1.4金黄色葡萄球菌的检测例1：陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄葡萄球菌进行了快速分离检验。取适量免疫磁珠，加入金黄葡萄球菌菌液中，磁场下分离磁珠，将分离前后的菌液及磁珠涂平板，并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此磁珠分离后，只有金黄葡萄球菌的浓度有明显的降低。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌，富集速度快，灵敏度高，效果好。例2：刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠