内吞与内膜系统

植物细胞胞吞作用和内膜系统的荧光显微观察植物细胞的吞排作用细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网(如蛋白质、脂类)和高尔基体(细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素)合成，运输小泡胞吐作用分泌至胞外或质膜上，促进新的细胞膜和细胞壁的生长另一方面，在细胞扩展增长过程中一些过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质等细胞成分，需要通过胞吞作用重新回到胞质中使之得以及时回收，循环利用，即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡在整个膜泡吞排作用（cytosis）中，必须有能量的保证。例如，膜泡组装形成过程中的小G蛋白，运输过程中的细胞骨架及相应的马达蛋白，以及膜融合过程中Rab蛋白等均发生GTP或ATP的水解反应。内膜系统(endomembranesystems)内膜系统是指内质网、高尔基体、囊泡、溶酶体和液泡等细胞器。这些细胞器的膜是相互流动的,处于动态平衡,在功能上也是相互协同的。FM类染料FM类染料是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便常广泛用于质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有FM1-43（Ex510/Em626）和FM4-64（Ex558/Em734）。FM类染料与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧光，需要借助胞吞作用才能进入细胞内。FM4-64在水相中没有荧光，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。FM类染料染色原理一、材料、试剂1.材料：烟草悬浮细胞2.试剂：1）烟草悬浮细胞培养基2）FM4-64（膜染料）3）叠氮化钠4）山梨醇5）ERTracker-Blue/White(内质网的特异染料)二、实验步骤a)取3个共聚焦专用培养皿，分别编号①、②、③；b)往①中加入198µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和2µLFM4-64；c)往②中加入178µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20µL山梨醇；d)往③中加入194µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和4µLNaN3；e)置显微镜下观察①中的荧光分布模式；f)观察完毕①中的FM4-64后再往①中加入4µLERBlue/white；g)往②、③中分布加入2µLFM4-64，随后先观察②中的荧光分布；h)接着再观察③中的荧光分布模式；i)最后再次观察①中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。内膜系统及内吞作用的荧光标记观察•取3个共聚焦专用培养皿，分别编号①、②、③；•往②中加入178µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和20µL山梨醇；•往③中加入194µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和4µLNaN3；•往①中加入198µL含BY2细胞培养液（1000mL移液器）和2µLFM4-64；•置显微镜下观察①中的荧光分布模式；•观察完毕①中的FM4-64后再往①中加入4µLERBlue/white；•往②、③中分布加入2µLFM4-64，随后先观察②中的荧光分布；•接着再观察③中的荧光分布模式；•最后再次观察①中FM4-64、ER-Blue/White双染下的荧光分布。三、结果与分析正常BY2的FM4-64标记FM4-64先标记于BY2外周，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。叠氮化钠处理的的BY2的FM4-64标记叠氮化钠能抑制BY2的呼吸作用，进而抑制细胞的内吞作用，导致FM4-64不会进入BY2内部，说明FM4-64是通过内吞作用而不是扩散进入BY2的。质壁分离的BY2的FM4-64标记用山梨醇处理BY22-3分钟，使BY2发生质壁分离，证明FM4-64是一种膜染料。ERtracker-Blue/white和FM4-64双标记细胞膜显示红色，而一部分细胞器显示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的FM染料部分进入内质网。实验报告1）FM4-64染料可以进行什么生理过程及细胞器的标记？2）你在实验过程中看到的FM4-64/山梨醇预处理及叠氮化钠预处理后再染色的实验现象有何不同，为什么？