荧光定量PCR

一、样品RNA的抽提1.匀浆将-80℃冻结的RNA提取样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状，向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAisoPlus，并将组织样粉末覆盖。2.抽提室温放置5min，使核蛋白复合物完全溶解后转移至1.5mL无酶离心管中，室温静置5min，12000r/min，4℃离心15min；小心吸取上清液移入新离心管，加上清液的1/5体积量的氯仿，静置10min；12000r/min，4℃离心10min。（此时分三层：无色上清液、白色蛋白层、带颜色的下层有机相）；3.RNA沉淀吸取上清液移至新离心管，切勿吸入中间蛋白层，向上清液中加入与上清液等量体积的异丙醇。颠倒混匀后室温静置10min，12000r/min，4℃离心5min（此时底部会出现沉淀）；4.RNA洗涤移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入1ml的75%乙醇（用DEPC水或无酶无菌水配制，超净台中配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下12000r/min离心5分钟。5.RNA溶解吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。加入无RNA酶的水20-40μL用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。二、RNA浓度和质量的测定1.1%-1.2%琼脂糖电泳检测RNA的完整性：将从肌肉中提取的总RNA吸取5μＬ，加入1μL6XLoadingBuffer,混匀，点入1%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，经凝胶成像系统检测条带。2.核酸蛋白分析仪检测OD；吸取2μL的RNA检测OD260/OD280检测含量与纯度，A260／A280在1.9-2.1之间，说明提取的总ＲＮＡ质量很好，记录稀释后RNA的Conc值（浓度）。三、实时定量引物实时定量引物根据NCBI公布的基因序列，依据实时定量引物设计原则，使用软件Primer5.0设计，管家基因引物引用参考文献所列，引物由上海生工有限公司合成。四、反转录宝生物（大连）工程有限公司TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)进行反转录，体系及步骤如下；1.反转录制备cDNA第一链采用SYBRGreenqPCR法反转录，体系如表。试剂添加量（μL）步骤１的反应液10.0PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0RTPrimerMix*41.05XPrimeScriptBuffer（forRealTime）4.0RNaseFreedH2O4.0Total20按表成分在冰上配制反应液。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装10μＬ到每个PCR反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。反转录条件；37℃15min；85℃５sec；4℃24ｈ。经过反转录反应得到的cDNA浓度为50ng/μL，将反转录产物于４℃冰箱中保存。2.实时定量PCR扩增本试验应用CFX96TM-TimePCRDetectionSystem扩増仪的操作方法。使用TaKaRaSYBR⑧PremixExTaqTMⅡ（TLiRNaseHPlus）进行实时定量PCR扩增。（1）实时定量PCR反应体系以上一步反转录获得的cDNA为模板，按表组份配制ＰＣＲ反应液（反应液配制在冰上进行）。以GAPDH基因作为参照基因，对样品中MyHCⅠ、MyHCⅡａ、MyHCⅡｂ、MyHCⅡｘ基因在RNA水平进行相对定量分析。目的基因与管家基因分别做３-４个平行样，每个岁龄的羊做10只平行，４次重复。PCR反应体系如表：（2）将配置好的反应体系装入12排八联管中，放入实时定量PCR仪中进行扩増。设置ＰＣＲ反应条件为：（3）经ＰＣＲ扩増反应后，将产物于４℃冰箱中保存。3.PCR反应产物检验吸取2μL的PCR反应产物，加入6XLoadingBuffer混匀，点入1.0%琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压电泳，用凝胶成像系统检测PCR反应产物的质量。五、数据统计分析实时定量PCR数据分析方法：本试验采用２-△△Ｃｔ法，计算公式：（１）相对表达量（foldchange）＝２-△△Ｃt；（２）△△Ｃｔ＝（Ｃｔ目的基因-Ｃt内参基因）处理组-（Ｃt目的基因-Ｃt内参基因）未处理组。1.紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。（1）浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5μl，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2.变性琼脂糖凝胶电泳测定（1）制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。（2）准备RNA样品取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。（3）电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。（4）紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。三、样品cDNA合成1.反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。2.混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。3.取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR1.β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。2.反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。3.管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。3.制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板1.针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。2.反应体系序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72℃延伸5分钟。（3）PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。六、待测样品的待测基因实时定量PCR1.所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。2.体系配置如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。（3）将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。七、实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。八、电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产