国家自然基金标书终稿

报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1、项目的立项依据随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产儿存活率已显着提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤（弥散性肺泡炎）和晚期的损伤后修复（肺间质重构）两个过程。细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重建正常，则损伤完全修复，肺结构正常；若ECM重建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）和其抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs)表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因[1]（具体研究成果见研究基础栏）。有关MMPs在高氧肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMPs过度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs的诱导剂和抑制剂两方面深入研究。细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,Emmprin）在上调MMPs表达中起关键作用。Emmprin是分子量为58KD的质膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部肿瘤细胞，提示Emmprin参与体内生理及病理过程[2]。目前，少数文献已证明，体外Emmprin与人成纤维细胞共培养后，成纤维细胞MMPs表达增加。进一步研究表明，Emmprin在细胞表面与自身受体或MMP结合，激活胞内MAPKp38信号通路，该途径激活促进ECM降解[3，4]。但关于Emmprin/MAPKp38对MMPs调节的研究仅限于肿瘤细胞，有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，Emmprin如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。转化生长因子β（Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β）在下调MMPs表达中起关键作用。研究证明TGF-β刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少[5]。另有研究发现，TGF-β抑制元件位于MMP-1基因启动子区，严密调控MMP-1在不同生理和病理情况下的表达[6]。进一步的研究表明，TGF-β对MMP-1的作用通过SMAD信号途径介导，该途径激活可阻止ECM降解[5]。因此，推测TGF-β/SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM重建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，TGF-β如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm大小的囊性凹陷结构—小窝（caveolae），是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白（caveolin）是小窝胞浆面包被的一种21-24kD的膜蛋白，是许多信号分子活性状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin通常与富集于小窝质膜上的各种信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动剂与受体结合后，caveolin分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，参与信号转导调控[7]。有关caveolin在肺ECM重建中的作用，有学者提出肺泡Ι型上皮细胞caveolin表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1α在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布[8]。研究发现，caveolin–1与TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）相互作用，抑制TGF-β介导的SMAD-2和下游分子的磷酸化，从而调节信号转导[9]。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为酪氨酸磷酸化依赖的MAPKp38途径，申请者推测caveolin能与Emmprin相互作用，调控Emmprin介导的MAPKp38和下游分子的磷酸化。简图如下：基于上述，申请者提出如下假设：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPKp38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。参考文献胞外信caveolin+?caveolin/Emmprin作用Emmprin/MAPKp38号刺激变构活化+caveolin/TβRⅠ作用TGF-β/SMAD信号整合调控肺ECM重建本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺泡灌洗术、体外Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累为本课题的开展奠定了坚实的基础。本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。7.RamirezMI,PollackL,MillienG,etal.Thealpha-IsoformofCaveolin-1IsaMarkerofVasculogenesisinEarlyLungDevelopment.JHistochemCytochem2002;50(1):33~428.DrabM,VerkadeP,ElgerM,etal.Lossofcaveolae,vasculardysfunction,andpulmonarydefectsincaveolin-1gene-disruptedmice.Science2001;293(5539):2449~522、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究目标：建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，探讨Emmprin与TGF-β调节失衡是否为高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对Emmprin/MAPKp38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。研究内容：1.Emmprin/MAPKp38信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性：①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38的表达。②研究高氧肺损伤Emmprin/MAPKp38信号通路活化状态与MMPs表达双变量关系。2.TGF-β/SMAD信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性：①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中TGF-β、TβRΙ、SMAD、磷酸化SMAD的表达。②研究高氧肺损伤TβRΙ的激酶活性，计算磷酸化SMAD与非磷酸化SMAD1.TaylorPM,WoodfieldRJ,HodgkinMNetal.Breastcancercell-derivedEMMPRINstimulatesfibroblastMMP2releasethroughaphospholipaseA(2)and5-lipoxygenasecatalyzedpathway.Oncogene2002Aug22;21(37):5765-722.LiangL,MajorT,BocanT.Characterizationofthepromoterofhumanextracellularmatrixmetalloproteinaseinducer(EMMPRIN).Gene2002Jan9;282(1-2):75-863.LimM,MartineT,JablonsD.Tumor-derivedEMMPRIN(extrocellularmatrixmetalloproteinasesinducer)stimulatescollagenasetranscriptionthroughMAPKp38.FEBSLett1998;441(1):88~924.YuanW,VargaJ.Transforminggrowthfactor-betarepressionofmatrixmetalloproteinase-1indermalfibroblastsinvolvesSmad3.JBiolChem2001;276(42):38502-105.WhiteLA,MitchellTI,BrinckerhoffCE.Transforminggrowthfactorbetainhibitoryelementintherabbitmatrixmetalloproteinase-1(collagenase-1)genefunctionsasarepressorofconstitutivetranscription.BiochimBiophysActa2000Feb29;1490(3):259-686.RazaniB,ZhangXL,BitzerM,etal.Caveolin-1regulatesTGF-beta/SMADsignalingthroughaninteractionwiththeTGF-betatypeIreceptor.JBiolChem2001;276(9):6727~6738比值。③研究高氧肺损伤TGF-β/SMAD信号通路的活化状态与MMPs/TIMPs的双变量关系。3.caveolin-1对Emmprin/MAPKp38和TGF-β/SMAD两条信号通路及其与高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性：①研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中caveolin-1表达及酪氨酸磷酸化水平。②研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与Emmprin的共定位。③研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1与TβRΙ的共定位。拟解决的关键问题：1.成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型的复制。2.本研究假设caveolin与Emmprin的相互作用可调控Emmprin/MAPKp38信号通路活化；caveolin-1与TβRΙ的相互作用可调控TGF-β/SMAD信号通路活化。以往由于技术条件限制，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记技术可解决这一技术难题。3、拟采取的研究方案及可行性分析。研究方法：本课题采用共聚焦显微镜（confocalmicroscope）、免疫荧光双重标记和免疫组织化学等研究方法，辅以蛋白质与核酸分析技术（WesternBlot、NorthernBlot方法），检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。1.建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型：参照申请者着作，实用儿科临床杂志，⑴.检测caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：①应用抗caveolin-1pAb进行免疫沉淀②应用抗磷酸化酪氨酸mAb进行WesternBlot分析⑵.检测肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P