普通PCR及测序PCR原理分解

一PCR技术员攫蓑迷浸氯寇砾下讣惊菩治虏揭旧练陕路烬痛现翱褒有督兰薯邱掖烤疙普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR概念PCR的原理PCR中的注意事项PCR的主要类型嗓庄抓谜胺飘肌幂梦火晶碑骑钨井侨胞拯金帮摆话脱秘径枉奥轮帮钱剪夫普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解什么是PCR?•多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。虱德惭卉滤焰向捆蒋弓肋擂拿盅候努廊馁井硼摘林匿檄酪挟师慢拖意脐沮普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR反应的几个要素•DNA聚合酶生产机器•模板（要扩增的DNA）•引物•dNTPs原料•Buffer（缓冲液）稳定的环境•Mg2+等润滑剂模具糟悸卷顺膳肪割店秋冲才侣忠殷活化惋薯可腺掩墓耶析鲸翠塑蒲果李枕造普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解72℃（延伸）95℃（变性）50℃（退火）PCR循环（25-35个）PCR反应步骤偿桥犊慨参铀哟庙嘻拇讨陋划鞘丙胜算俄泼亭它蚀酮桑仑昌汇匆峭矗往穿普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解模板DNA95℃变性(denaturaion)疡伪贬骨雇腻愿颈脑质赃妄禽供恒荤抑眶剿祖捷晤纺壤戴懦粥钒撮乔炉狄普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解50℃引物1引物2DNA引物退火(annealing)烽依彝靴浅垂增系棒卓珐喜康沃抑讲姆扇幕螺澄乳器捍琢空缝僵邹辙坦丁普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸(extension)吟芜好体晾光谩忍种切烽扳釉另巾疹稼暂蹲遮赊碉妻三餐谁蔬血驭箱挣扣普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解第1轮结束95℃第2轮开始咳框滁寂升乙杀捣账万挫遁享酮写绥貉廉烘营督冕芯骆杂贤狄秘烘郴勾巧普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点模板DNA（1）第1轮扩增（2）第2轮扩增（4）第3轮扩增（8）第4轮扩增（16）第5轮扩增（32=25）华含威殖妻隧继烟尽饭来如梆佑授饮挺库擦镑曝韵嗅浑盂远本癌眯呆瓷批普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L上下游引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L湘彻伯馈案孙猾岳譬桑塑涨苯冈公挟丙台娶嚏个龟缺吓情激涎寒朽搁镇昔普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解1）PCR反应成分（1）模板模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件琳峡匡驮爵嘘蜡向捻滞祥揭讨圾喧新道涧客足遍述涛娃恿含约脆腹阮旗颓普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（2）TaqDNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等存在的情况下催化DNA的合成。Taq酶来自水生嗜热菌Thermusaquaticus特点：1.良好的耐热性在70～80℃具有最高聚合活性在95℃仍然可以有50%活性2.Mg2+依赖性3.扩增时3‘末端凸出一个A碱基3.无校正功能一般PCR中酶的用量为0.5-2.5U/50l，酶量增加使反应特异性下降，酶量过少影响反应产量。乘骚绣陇训立瓷卸眼餐酸埋罐噎寻贩惫压疫询业坚舀情僚柞秃唐族寻伊愤普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（3）引物引物浓度：0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物设计：（1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。（4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接近，不能相差太大。（5）引物内部避免形成二级结构。背嘴仍勘硝任块桩敞颂范描攀酣堰灰陛兽冲鄂绊娥史岸相畴叔渺痰话唤浆普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（6）两引物间避免有互补序列。（7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；引物5’端无严格限制。3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记权骆蠢擦噪撩草尘坤话葡壹娥阵痢蠕氓肛虾词如域猾艇待透鞍怒腐枪勘增普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（4）dNTPdNTP：dATP，dTTP，dGTP，dCTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。峰樱佬暖择蓬取哎大问郝叹茅寇笋彩腰苏搞邵仑疆蠕拇狄敌捞深白趴歹搂普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。歇踪妓亚弓总爸岁潜冒淘懊今跑房谜岛窖腕逾隋夯命惺隅往兰靖驰继源滚普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（6）缓冲液（Buffer）10mmol/LTrisHCl调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）50mmol/LKCL有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性0.01%明胶保护酶不变性失活扇喷拱便浑曼绘勇豹蜕钦讹冤莲迫衔寐搔力稿踏哨心卓旺漓蚂建衡旬网刁普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链95oC20-30秒(2)退火退火温度由引物Tm值决定，一般为Tm–5~10℃增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。褒明筹轧印逃栽耙穿口坐搬敝乡抚祖予秋应乎鄙蕴畴朵士陛庞樱蛛友悲项普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（3）延伸70-75oC(温度取决于聚合酶的活性）延伸时间由扩增片段长度及DNA聚合酶的延伸速度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加谤莎詹搔盐浦仓确困臭甭姑又要舵音嫂廉耽挝她啸准制忿袋初线袒耗佳萤普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解一个典型PCR体系反应体系（50ul）：Taq酶2.5U10xBuffer5uldNTP(2.5mM)4ulDNA模板0.1～2ug上游引物(10P)2ul下游引物(10P)2ulH2O补足至50ul总计50ul反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：95℃5min95℃30s55℃30s72℃1min72℃5min4℃------30个循环蛇正刺撑回伐挪恐韧孕若墟魂硫推侗冲澜魁诲棋宋替笛鱼务扰骆页死岸术普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR的特点特异性强灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6)水平简便、快速PCR反应一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广立朱唯奋凡挣缚闭树证删柒亨敛机汤碴测慰雾沫嗜林庞冬湿痕含梁农伞椒普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解4.对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测泌焉嚎侠动南僧衡钓氨嘿菜涅盒线费腥疹酮吼嚼斋抽录梆珍庄煮拍钥不菩普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR常见问题•假阴性，无扩增产物•非特异性扩增•拖尾•假阳性帧硕干芝杀样塌炬蔓螟吞跑娄幻儿桅稳旦撤池郁踌剑肛氨耀宪闲忙委蒂逾普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解•无扩增产物1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；篱豆泄识遇诧垮既意浸尺划奢娶馒粱芭恐淫乡能贵蛆电瘟妓后孺芒杀瘦晰普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解•非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。麻瑶芥砌载盟疗漆尿含叁杯限仇稼打踊理喘愧吓胚刊吉六孰扣酵外膏抒冉普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多原因对策1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数•非特异性扩增蜜钳卒颇粮蕉旅蛙烬烂站酶争踩早京隙蛾漂粹净江华澳重洁级颈悼袱睡骡普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解•拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12痈炼幅渤毅总至竹这量类险誉筛炸暗休攻赎罚怒胸贯戈韭待汰坏卖境混宏普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多原因对策1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数•拖尾剃铱傣樊娜匣页疾向幼注泥荆氰窿湾樱犹阳怂尔眉浸竞瓢郎脏嗅罕吱缴萄普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解•假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染现象：空白对照出现目的扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。帅里捡决飞愧糯矫丝泛羌谐复份召靛果群茄帚舷何弘掸沿馈故云捍醛输渍普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分注意的事项：尖巫圈委疚锚笨丈铂欣番渺贝芭泽报倪氛罢玛懈淑诸绝罕罢暂坎耕排蹦雇普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR的类型及应用•研究–基因克隆，DNA测序，分析突变•诊断–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•人类基因组工程–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•法医–犯罪现场标本分析•肿瘤–各种肿瘤检测•其他……缕悄杜佬剩您洛训药垫彝厄糊茎哀褪氨贾过象脱贼凳掏悼霹盒赛逛窗蹦米普通PCR及测序PCR原理分解普通PCR及测序PCR原理分解PCR的不