微生物代谢工程研究进展

1第十讲微生物代谢工程研究进展2微生物代谢工程研究进展微生物代谢工程概述微生物代谢调节微生物代谢工程的应用本章内容微生物代谢工程概述微生物代谢调节3第一节微生物代谢工程概述细胞的生命活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，而代谢网络是由一系列酶的级联化学反应以特异性的膜转化系统构成。对人类的应用而言，活细胞自身固有的代谢网络的遗传特性并不是最佳的，为了积累大量的某种代谢产物，就必须要打破并重建细胞的代谢平衡。41、代谢工程概念的演变名称定义参考文献（微生物）途径工程利用DNA重组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有的代谢途径），提高特定代谢产物的产量MacQuitty,1988代谢工程利用DNA重组技术优化细胞的酶活、运输和调控概念，提高细胞活力Bailey,1991代谢途径工程生化途径的修饰、设计与构建Tongetal,1991代谢途径利用DNA重组技术对代谢产物进行目的性修饰Catneron,1993代谢途径/代谢设计改造细胞途径代谢途径，提高天然最高产物产量或合成新产物（包括中间产物或修饰型最终产物）Pieperberg,1994代谢工程对生化反应的代谢网络进行目的性修饰Gregory，1994代谢工程为达到所需目标对活细胞的代谢途径进行修饰William,1996代谢工程利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略，从而优化细胞生物学特性Koffasl,1999一、微生物代谢工程的概念5代谢工程是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络,并通过DNA重组技术和应用分析生物学相关的遗传学手段对细胞进行有精确目标的基因操作,改变微生物原有的代谢或调节系统,实现目的产物代谢活性的提高。目前对代谢工程较系统的定义代谢工程的研究目的通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌并用于生产。6目前代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质在不同途径中的流量分布。典型目标是修饰初级次级代谢，将碳架物质流导入目的产物的理想载流途径以获得产物的最大转化率。2、代谢工程要解决的问题7(1)提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；(2)改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物；(3)对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物；(4)优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。3、代谢工程主要应用方向84、代谢工程三个基本观点三大观点代谢能支撑观点代谢网络观点细胞经济观点时间性空间性整体性流动性层次性自主性微生物代谢的复杂性95、反向代谢工程范例：利用透明颤菌血红蛋白来缓解供氧不足。Bailey研究小组克隆了透明颤菌的血红蛋白基因,并通过在大肠杆菌中表达该基因,大大地提高了大肠杆菌在微氧环境中的细胞生长。概念：是一种采用逆向思维方式进行代谢设计的新型代谢工程。就是先在异源生物或相关模型系统中，通过计算或推理确定所希望的表型，然后确定该表型的决定基因或特定的环境因子，然后通过基因改造或环境改造使该表型在特定的生物中表达。10二、微生物代谢工程的发展历程天然发酵时代微生物发酵已经有几千年的历史，早在2000多年以前，人们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的发酵，此时的发酵被称为。现代发酵工业时代20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行，开始了。通过自然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段。11自然发酵时期早在数千年前，我国劳动人民就懂得酿酒、制酱油、酿醋等。酿酒工业是历史上最古老的微生物工业，但当时人们并不知道它与微生物的关系，也不清楚发酵的原因，只是靠口传身授，在实践中应用微生物。微生物代谢工程的发展历程12纯培养技术时期1667年，荷兰人列文霍克发明了显微镜，揭开了微生物世界的秘密。随着微生物的发现，年法国巴斯德通过实验发现了发酵原理，认识到发酵是由微生物的活动引起的微生物代谢工程的发展历程13通气搅拌的好气性发酵工程技术时期1929年，英国细菌学家傅莱明发现了青霉素。随着青霉素大规模生产的成功，实验室采用摇瓶通风培养以及空气纤维过滤的高效除菌，在20世纪40年代创立了好气性发酵通气搅拌工程技术。微生物代谢工程的发展历程14人工诱变育种与代谢控制发酵技术时期随着微生物遗传学、生物化学和分子生物学的发展，日本于1956年用发酵法生产谷氨酸获得成功，促进了20世纪60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立，这是遗传水平上控制微生物代谢的结果。微生物代谢工程的发展历程15发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期随着微生物工业向大型发酵罐的连续化、自动化方向发展，以数学、动力学、化工原理等为基础，通过计算机实现发酵过程自动化控制的研究，使发酵过程的基本参数均可自动记录和控制。微生物代谢工程的发展历程16微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期随着微生物酶反应生物合成与化学合成工程技术的结合，矿产物的开发和石油化工的发展为化学合成法提供了丰富的原料，用于生产一些低分子的有机化合物，如乙醇、丙酮及丁醇等，可生产许多过去不能生产的有用物质。微生物代谢工程的发展历程17三、微生物代谢研究的相关领域（一）微生物代谢组学研究概念：是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科。是通过考察生物体系收到刺激或扰动后所有小分子代谢产物随时空变化情况，来研究生物体系的代谢途径的一种技术。代谢组学优点(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；(2)代谢组学的研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目：(4)由于给定的代谢物在每个组织中都是一样的，所以，研究中采用的技术更通用。18（二）微生物代谢产物库研究1.预分离代谢物库：首先多种菌株的培养液过滤，其次经不同吸附性色谱柱、半制备高效液处理细分得到多种一定纯度的天然化合物，最后对化合物库中活性成分进行液相-质谱、核磁共振分析，排除重复性物质。2.纯天然产物库：首先选择培养条件简单，能产生多种含量丰富未知代谢物的微生物作为实验对象。采用高效液相结合蒸发散射检测器对所选微生物进行预筛选,从中挑选出目的菌株做进一步的扩大培养。其次提取物先浓缩、分离，最后通过查询天然产物数据库结合质谱、核磁共振信息对分离获得化合物进行高通量结构鉴定从而得到微生物代谢化合物。19（三）微生物代谢分子生化技术研究基因敲除启动子和细胞全局转录机制的定向进化201、基因敲除基因敲除是利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。通过阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的目的。例如在提高产物纯度上：乳酸菌LactobacillushelveticusCNRZ32既有Kyla．D．乳酸脱氢酶基因(ldhL)，又含L乳酸脱氢酶基因(1dhD)等。用基因替代的方式构建了2株菌GRL86和GRL89，其中GRL86菌株缺失了ldhD的启动子区域；GRL89菌株中用另一个ldhL基因替代了ldhD基因，新增加的ldhL在原来ldhD启动子的调控下表达．敲除后，两株菌都只生产L-乳酸，且L-LDH的最高活性分别比原始菌株高出53％和93％。21提高通向目标产物的代谢流增强催化某反应的酶的表达量和活性或在有竞争途径存在时，阻断分支代谢途径，从而提高代谢流，达到提高目标产物产量的目的。扩展代谢途径通过基因工程手段引入外源基因（簇）等，使原有代谢途径进一步向前或向后延伸，从而可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端代谢产物。构建新的代谢途径一般指引入外源基因（簇）来改造和修饰代谢网络，转移代谢途径或将无关的代谢途径相连使细胞从不能合成某种代谢产物转变为能合成此代谢产物。四、代谢工程研究的设计思路22自然分离随机突变鉴定目标代谢途径绘制细胞代谢图谱代谢分析代谢网络定量分析待修饰基因靶点的确定待阻断途径靶点的确定待导入途径靶点的确定基因操作代谢设计代谢流分析工程菌或细胞品质检测、遗传稳定性试验细胞培养工艺优化控制投入生产或运用基因操作效果分析代谢工程路线否是代谢工程的基本过程23五、代谢工程的研究手段1、采用遗传学手段的遗传菌种改良酶的合成或酶活的提高2、生物合成途径的代谢调控支路代谢的切除转移代谢途径或将无关代谢相连24从野生型大肠杆菌出发，将来自假肠膜明串珠菌LeuconostocpseudomesenteroidesATCC12291菌株的甘露醇脱氢酶与果糖转运蛋白编码基因整合到大肠杆菌ATCC8739的染色体中，并失活其他的发酵途径(丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、富马酸还原酶、乙醇脱氢酶、甲基乙二醛合成酶和丙酮酸氧化酶)，构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株。25第二节微生物代谢调节微生物代谢的代谢类型和自我调节初级代谢调节次级代谢调节26现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：多种方法育种选育基因突变株控制培养条件，调节代谢27代谢调节(regulationofmetablism）是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。28细胞内发生的各种化学反应的总称为代谢！（一）代谢类型一、微生物代谢的代谢类型和自我调节29（二）代谢自我调节部位（方式）细胞透性的调节代谢途径区域化代谢速度的调控301、细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。312、代谢途径区域化原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，与某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。32在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。333、代谢速度的调控微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。34初级代谢微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢类型二、初级代谢调节酶合成调节酶活性调节351、酶合成的诱导诱导酶是微生物需要它们时才产生的酶类，所以诱导的意义在于它为微生物提供了一种只是在需要时才合成酶、以避免浪费能量与原料的调控手段。乳糖是大肠杆菌β-半乳糖苷酶合成的诱导剂。（一）酶合成的调节362、酶合成的阻遏微生物代谢过程中，当胞内某种代谢产物积累到一定程度时，不仅可以反馈抑制产物合成途径中某种酶的活性，还可以阻遏酶的继续合成。37（1）末端产物阻遏由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏称为终产物阻遏。常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。正常情况下，当微生物细胞中的氨基酸、嘌呤和嘧啶过量时，与这些物质合成有关的许多酶就停止合成。38意义有效地保证了微生物细胞内氨基酸等重要物质维持在适当浓度，不会把有限的能量和养料用于合成那些暂时不