外周血细胞形态学检验及诊断技巧

外周血细胞形态学检验及诊断技巧主讲：卫生部北京医院郑天林录制：卫星卫生科技教育网监制：卫生部科教司一.概述（一）血细胞形态学基本概念（二）血细胞形态学检查方法（三）血液学及血细胞形态学临床应用（四）临床/形态学诊断与血液学检验及专业人员素质问题二．血细胞染色法（一）细胞染色机理（二）瑞氏染色（三）姬姆萨染色（四）瑞氏-姬姆萨染色液鉴定（五）瑞氏-姬姆萨混合染色三．形态学与血液检查与自身特性（一）血常规（二）白细胞分类（三）骨髓外周血细胞形态学及分类（四）血细胞涂片特性四．血细胞形态学采样、制片与检查程序（一）采样、制片、染色工序至关重要（二）染色五．外周血细胞形态学检验技巧（一）WBC形态学（二）红细胞形态学（三）出现有核（内/巨幼）红/幼粒细胞意义（四）血小板巨核细胞六．外周血细胞形态学检查步骤、注意事项及检查报告书写内容（一）注意事项（二）外周血涂片检查步骤（三）外周血涂片报告内容一、概述（一）．血细胞形态学基本概念（二）血细胞形态学检查方法（三）血液学及血细胞形态学临床应用（四）临床/形态学诊断与血液学检验及专业人员素质问题一．概述血细胞形态学是血液病基础诊断与血液学检验的重要项目●正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正常范围，不同血细胞及细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。●观察血细胞形态和数量及其比例的变化来研究造血器官的结构和功能是血液学的重要组成部分，是诊断造血系统疾病最基本、被临床普遍应用的最简便实用的检查方法。●在造血系统疾病发生造血功能紊乱，引起血细胞形态学的量和质的改变。在临床各科某些原发性疾病患者出现继发性血液学形态学的病理改变，籍以了解患者机体状况如感染（细菌、病毒、寄生虫、药物）等反应。●血细胞形态学检查是为临产提供诊断依据，应备有患者的临床表现基础检查初步诊断的病历摘要，才能进行形态学检查。必要时还要做骨髓活检（切片、活检材料滚片、活检穿刺针残液图片）细胞化学染色,免疫学表型等检查的必备程序。●血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成，必须平行进行检查。外周血细胞改变往往反映骨髓病变的重要信息，有利于诊断。●疑似血液病和血液学检查异常情况不能只依赖使用分析仪做血常规检查而废弃镜下血涂片细胞形态学检查的错误倾向。二）细胞形态学检查方法1．光镜细胞形态学；细胞形态学的基本内容和常用的检查方法，广泛用于临床方法。2．细胞化学染色：是细胞和化学两者相结合的形态学方法，保持细胞完整组织结构显示化学结构成分-定性/半定量，主要用于白血病分型鉴别诊断3．相差镜检查：用于观察活细胞的内部结构及活动，细胞生长成熟衰亡过程及对各种刺激的反应4．荧光显微镜检查用荧光染色血细胞，常用于DNA、RNA的检查。近年来由于流式细胞仪的应用而逐渐被替代。5．电镜（透射/扫描）观察细胞超微结构改变了不少光镜细胞结构概念，在形态学上是对光镜的一个重要扩展和补充。6．骨髓组织病理学检查是对骨髓涂片检查的一个重要补充，相互补遗提高诊断水平。（三）血液学及血细胞形态学临床应用：●是临床血液病诊断与治疗及临床医学检验学的基础工作。●血细胞形态学适用于临床血液病诊断的基础诊断快速简捷的要求。●近年来由于血细胞学及超微结构、细胞化学、造血干细胞及其细胞因子、骨髓造血微环境、基质细胞、树突状细胞、淋巴系细胞发生及其疾病表现，细胞增殖动力学与细胞凋亡以及骨髓组织病理学免疫学、细胞遗传学、融合基因、分子生物学的血液分析仪、流式细胞仪的应用，推动了血液病与血液学的新知识迅猛发展。●当前血液病不能单凭临床与形态学作出诊断，必须以临床和血细胞形态学为基础，将免疫学、细胞遗传学及分子生物学新知识、新技术应用到血液学中，构成现代临床血液学与分子生物学诊断技术，弥补形态学的经验性与主观性带来负面缺陷，才能提高血液病的诊断与治疗水平达到WHO新分类的分子生物学水平。进入90年代以来，国内外采用多学科联合技术综合诊断技术与方案：○FAB-AL（1976）、NCL（美国国家癌症研究所1990）对FAB-AL分型的补充建议、AL-MIC分（类）型及MICM分型（1985-1990）；○FAB-CL分型（1989）、中国CL分型（1997）；○FAB-MDS分型（1982）、MIC协作组对FAB-MDS分型提出补充建议（1987）；○WHO对造血系统及髓系恶性疾病和淋巴系恶性肿瘤WHO分类（2000）血细胞形态学诊断技术正在进入显微图象软件时期：○创造出许多多功能软件，如血细胞形态学、细胞化学染色、血液病诊断与鉴别诊断、CL诊断与治疗及教学系统多媒体软件等。○将显微镜与微机相连，应用储存、分类、检索软件，编辑、打印诊断报告，并可附多幅细胞图象。（四）临床-形态学诊断与血液学检验及专业人员素质●普遍存在临床与实验室知识面分离现象：○临床医师缺乏实验室知识和技能，甚至不掌握基本形态学能力，诊断依赖实验室报告○实验室人员往往缺乏血液病基本知识与诊断及鉴别诊断的能力“就形态论形态”，常有报告不确实●具备临床与细胞形态学等实验室技术、知识的双重本领及其相互融合十分重要。缺其一都是血液专业上的缺陷。●随着血液分析仪普及和档次升高而忽视废弃形态学检查的错误倾向。即是最好的五分类血液分析仪也不能替代镜下形态学观察，否则导致延误或漏诊严重错误的发生●形态学诊断是十分费时、细致、艰苦的工作，来不得半点虚假，因此形态学专业人员要具有高素质的基本条件：○要充分发挥人的主观能动性；○要具有较高的形态学水平、全面的临床与血液学及有关边缘学科知识，才能算得上德材兼备的优秀专业人才。○因此只有认真观察与思维才能发现问题，解决问题。应牢记著名微生物学家-巴士德铭言“在观察的领域中，机遇总是偏爱那些有准备的头脑”。●树立起临床疾病的正确思维程序，遵循循证医学起到“纲举目张”的功效。是指导在临床和检验实践中确立诊疗时应以个人知识与技术和当前获得最佳的临床资料与参数有机的结合起来，充分运用诊断与检验技巧在工作中取得更多的客观依据，才能把血液病诊断与血液学检验提高到新的高度。所谓技巧就是解决实际问题的诀窍。二．血细胞染色法（一）细胞染色机理：染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用，使其清楚显示细胞各个组成部分，有利辨识细胞形态。●染色可分二个步骤：1．染料受相应物质吸附而附着于物质表面；2．固着作用：○即染色粒子进入细胞内起化学反应（染料透过细胞膜的学说很多，尚无定论），与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。○染色剂皆有选择作用，其染色不是将细胞全部一齐着色，而只是将其中一部分染色，多余的被冲洗掉。目前多以吸附学说（电力吸附、机械吸附、化学吸附）来解释。●一般染色方法由两种染色剂（酸性、碱性）组成，通常细胞核及浆碱性粒体为碱性，细胞浆为酸性。○酸性染料可和带正电荷的（碱性）物质结合，这种物质称嗜酸性物质，对酸性染料具有亲和力，因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质；○碱性染料可和带负电荷的（酸性）物质相结合，这种物质称嗜碱性物质，对碱性染色粒具有亲和力。○另一种蛋白质在pH6.4呈等电状态，本身所含的正/负电荷相等，既能和酸性染料又能和碱性染料结合，这种物质称中性物质，如中性粒细胞之颗粒。●一般用pH6.4PBS来稀释染液：○在恒定条件下着色，使染色效果趋于一致。○染液过碱时，蛋白质带有负电荷，对次甲蓝有色部分的正电荷吸附力强染成的细胞一般着色较蓝，说明pH不适合。●染色与固定亦有极大关系：○因细胞经固定后，其蛋白质的电力吸附（电附）可能有变化，有些固定液能将细胞某部分的电附加强，使其染色更为容易。○伊红与胞核虽无电附仍有机械吸附，能染上少量红色，苏木液与胞浆虽无电附但也有机械吸附，因而胞浆略显蓝色。●血细胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆萨染色两种，○作者取其两种染色的优点，采用瑞氏和姬姆萨混合染色法，比单用一种染色法更佳。○一些快速和改良染色方法及染色液商品化，对血细胞形态染色不一定适用。（二）瑞氏（Wright’sstaim；美蓝－伊红Ｙ）染色：1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlemblue）和酸性染料黄色伊红（EostmY）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Ｙ）染料。2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。甲醇ME（瑞氏染料）----→M++E-在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。3.瑞氏染液配制：(1)瑞氏染液配制：瑞氏染料830gm或1g甲醇（AR）500ml或600ml○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。(2)缓冲液：●缓冲液作用：○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH一般在6.4~6.8，○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。●缓冲液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：配方1：配方2：1%KH2PO430mlM/15KH2PO473.5ml1%Na2HPO420mlM/15Na2HPO426.5mlH2O(新鲜)加至1000ml置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。（三）姬姆萨（Giemsa’sstain；天青-伊红）染色1．姬姆萨染料是伊红(AzurIIEqsin)和天青（蓝）2号合成的。2．姬姆萨染料（Giemsa,天青-伊红）染液配制：姬姆萨染料（粉末）0.5g或7.5g甲醇（AR）33ml或500ml甘油（AR）33ml或500ml●先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于56℃水温箱内，90～120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。●使用染液可临时配置）：姬姆萨染液1ml，加DDH2O10ml混匀。即可使用。3．染色步骤：（1）先用甲醇固定2～3分钟。（2）将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液15～30分钟。（3）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。（四）瑞氏或姬姆萨染色液鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定：1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。2．取1滴染液加1滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色。3．取血片或骨髓片进行试染检查，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况，pH是否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。（五）瑞氏染色(Wright’s)-姬姆萨（Giemsa’s）混合染色：●瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。●姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰,色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。●故采用以瑞氏染液为主，姬姆萨染液为辅的混合染色。染色步骤:1.先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；2.稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)；3.稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢