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QTRAP实战指南之一----IDA的应用技巧2009-5郑州李立军2020/3/1ABSCIEXMarketingteam2同时定性定量和快速定性的方法——IDA的应用•我们比较熟悉的LC-MS定性方法,通常是需要LC将各组分分开,通过MS得到各组分的分子量及碎片信息,对于不太复杂比较少的组分,比较容易,若很多组分同时定性,则往往需要做几遍才行。•以往的多组分同时定量定性,采用LC-MRM,至少两对MRM,其中一对定量,一对定性,这样一次最多分析一百多种化合物。•最新的多组分同时定性定量,采用信息相关扫描方式(InformationDependentAcquisition)即(IDA)。•已经在法医毒物鉴定、中毒抢救和残留监测中得到成功应用2020/3/1ABSCIEXMarketingteam33DTrap全扫描灵敏度高MS3或更多QqQMRM灵敏度和选择性中性丢失母离子扫描子离子扫描MS2三重四极杆/线性离子阱串联质谱技术3200QTRAP®3200QTRAPSystem全扫描灵敏度高MS3MRM选择性和灵敏度中性丢失母离子扫描2020/3/1ABSCIEXMarketingteam4LITQQQEnhancedMS(EMS)Q1/Q3Start/StopEnhancedMultiplyCharged(EMC)*EnhancedResolution(ER)增强分辨率扫描EnhancedProductIon(EPI)增强子离子扫描ProductIonTimeDelayedFragmentation(TDF)*MS3PrecursorIonNeutralLossMRM*这些扫描方式主要用于蛋白大分子的应用LITandQQQScansMSScansMS/MSScansQ1/Q3CenterWidthQ1MI2020/3/1ABSCIEXMarketingteam51.Q1和Q2传输离子(RFonly)2.选择的质量范围的所有离子在LIT中捕获3.进行扫描增强全扫描(EMS)Q0Q1Q2Q1Q2LITRFonlyRFonlyCAD=highIQ3EXBTrapionsExciteScan2020/3/1ABSCIEXMarketingteam6增强分辨率扫描(ER)1.Q1选择的离子在+/-15amu窗口被传输到Q22.离子被传输通过Q2(RFonly)3.离子在LIT中捕获4.在离子在窄的质量范围,以250amu/sec扫描速度扫描出LITM+/-15amuRFonlyCAD=highTrapionsExciteScan@250amu/secQ0Q1Q2Q1Q2LITIQ3EXB2020/3/1ABSCIEXMarketingteam7Q1扫描ER扫描C27H38N2O4C21H23NO2FCl根据同位素分布提供药物结构线索2020/3/1ABSCIEXMarketingteam81.在Q1选择母离子2.在Q2打碎3.碎片离子在LIT中捕获4.捕获的离子扫描出LIT增强子离子扫描(EPI)ExciteScanPrecursorSelectionRFonlyCAD=highTrapionsQ0Q1Q2Q1Q2LITIQ3EXB2020/3/1ABSCIEXMarketingteam9提高灵敏度ReserpineQTRAP™System—EnhancedProductIonScanEPIQQQProductIonScan500x2020/3/1ABSCIEXMarketingteam101.在Q1选择母离子2.在Q2打碎3.碎片离子在LIT捕获4.在LIT中,RF/DC分离选择离子5.在LIT中对分离选择的离子进行激发6.质谱扫描MS/MS/MS扫描(MS3)1stPrecursorSelectionRFonlyCAD=highTrapProductsSelect2ndPrecursorQ0Q1Q2Q1Q2LITIQ3EXBFragmentTrapScan2020/3/1ABSCIEXMarketingteam11MS3参数设置:CE:MS2的碎裂能量设置AF2:MS3的碎裂能量设置1st:MS2的母离子m/z设置2nd:MS3的母离子m/z设置2020/3/1ABSCIEXMarketingteam12维拉帕米的EPI和MS3扫描EPIm/z455MS31stprecursor:m/z4552ndprecursor:m/z1652020/3/1ABSCIEXMarketingteam13三重四极杆串联质谱•多反应离子监测MRM•子离子扫描•母离子扫描•中性丢失扫描•全扫描•SIMQtrap:解决定量+定性问题线性离子阱质谱•增强子离子扫描(EPI)•MS3•增强全扫描(EMS)•增强多电荷扫描(EMC)•增强高分辨扫描•时间延迟碎裂扫描(TDF)QTrap•MRM-EPI(子离子扫描)•MRM-MS3•母离子扫描-EPI•中性丢失扫描-EPI•EMS–EPI•……灵敏度、稳定性、重现性完全一致2020/3/1ABSCIEXMarketingteam14什么是IDA?•采集方法自动选择候选离子进行MS/MS试验•根据动态排除能力进行循环试验•运用多种预扫描确定进样MS/MS的候选离子•通常用于代谢物鉴定、药物毒物以及食品农药残留和兽药残留的筛查、天然药物等的鉴定分析2020/3/1ABSCIEXMarketingteam15为什么要用IDA?•一次进样,可以得到非常多的信息,成倍的提高效率,充分利用资源。•由于通常的MS2灵敏度较低,所以不推荐在QQQ仪器上做IDA,而QTRAP的EPI灵敏度比MS2提高2个数量级以上,所以才能在1-2次扫描中得到高质量的图谱,能够进行库检索,从而准确定性。但MS2谱与EPI谱差别并不是很大,可以一样进行库检索。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam16IDA的几种方式•MRM-EPI高灵敏度的筛查和同时定性定量等•EMS-EPI未知物定性,例如药物代谢物、天然产物鉴定•NL/PREC-EPI代谢物、中药天然产物的定性,PTM•EMC-EPI肽、蛋白定性,•EMS-ER-EPI肽、蛋白定性,•EMS-EPI-MS3未知化合物定性2020/3/1ABSCIEXMarketingteam17IDA(InformationDependentAcquisition)实现方法如下:2020/3/1ABSCIEXMarketingteam18IDA方法的建立建立方法可以通过“BuildAcquisitionMethod”或“IDAMethodWizard”通过IDA方法向导建立方法,根据说明一步一步进行。采集方法编辑方法需要用于添加和设置需要进行的试验2020/3/1ABSCIEXMarketingteam19IDA向导的设定•用户选择要进行的实验类型,包括预实验扫描和关联性的扫描•可选择ER扫描得到精确m/z电荷状态•选择MS3产生另外的关联扫描•选择动态填充时间2020/3/1ABSCIEXMarketingteam20通过软件向导进行多目标筛查IDA方法的建立:•适合于农药、兽药残留筛查,中毒抢救和毒物毒品控制等的同时定性定量。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam21实现方法1232020/3/1ABSCIEXMarketingteam22选择手动输入MRM离子对122020/3/1ABSCIEXMarketingteam23可以按照文献资料中的MRM数据输入,Analyst1.4.2最多300对Analyst1.5最多可以2500对(采用sMRM),小分子不使用自动CE122020/3/1ABSCIEXMarketingteam24如图设定是同一母离子按照20,35V两种不同能量得到2个EPI图Monitor可以选择1-8个,每次对最强的1-8个离母子进行MS/MS。如下所示,在窗口上方设定,建议不要超过3个,通常选1个1232020/3/1ABSCIEXMarketingteam25•EPI实验的碰撞能量(CE)可以通过两种不同的方式设定。选择的每一个母离子可以至多有三个不连续的碰撞能量。例如,如果两个最强的离子被选择,两个不连续的碰撞能量被设定,那么在每次循环中将进行4个独立的EPI扫描,分别为两个母离子不同CE的EPI谱。•如果仪器是3200Q以下,建议Monitor选一个,EPI也选一个,并采用CES,如果是4000Q以上,则可以选3个EPI。•质量范围不必太宽,最低50amu,最高比最大母离子高10个amu足够。•每对MRM可以分别设DP和CE,EPI只能取平均DP,CE与数据库中一致。•如果设定Monitor2个母离子按照同样20V能量,最后图谱中得到2张EPI图小经验2020/3/1ABSCIEXMarketingteam26通常用MRM-EPI可以将阈值设为数百CPS,若全扫描-EPI,则要数万以上。ExcludeFormerTargetIons标准可以排除已经做过MS/MS的离子。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam27选择Always可以将这些离子从剩余的运行中排除选择For_(sec),可以排除在设定的时间窗口洗脱的母离子不再进行MS/MS扫描选择Never打勾,动态排除关闭选择After_occurrences,允许选择离子在排除之前进行几次MS/MS扫描。此处输入1,则离子在排除之前进行多于一次MS/MS扫描。如果不打勾,则与输入0是一样的,只做一次EPI。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam28•建立好IDA方法后,IDACriteria里面的参数还可以修改,Select1to2表示2个最强的母离子每个做一次EPI,如果1to1则2个EPI可以是同一母离子而CE不同;右上角动态背景扣除应该打勾(只有Analyst1.5有);MassTolerance只对EMS、prec、NL等全扫描模式起作用,MRM不必理会2020/3/1ABSCIEXMarketingteam29•Analyst1.4.2中动态背景扣除(DBS)在Script中,开始实验之前需要激活。在激活DBS后,ExcludeFormerTargetIons标准可以选择Never。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam30•Inclusion/Exclusionlist可以设定必须采集EPI的母离子和明确知道在某保留时间的干扰离子,通常MRM-EPI很少用到。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam31从IDA向导产生的方法•试验参数在保存方法前可以修改调整•LC方法和总的运行时间,需要用户自己设定点击编辑参数,确保设定的参数正确2020/3/1ABSCIEXMarketingteam32TurboIonspray源,正离子模式IS设为~5500V(负离子模式为~-4500V),GS1和GS2则与流速和流动相组成有关(流速越高,GS1和GS2也应该越高)。通常200ul/min流速温度设为550度左右,GS1,GS2均为50-70。具体要根据MRM优化的结果而定。点击OK,保存参数。CUR在不影响灵敏度条件下,尽可能大点选择窗口底端的一个或两个钮,Source/Gas或Compound的参数可以用于所有的实验。注意:MRM的CAD往往是数字表示,例如5,6,而EPI往往是用高、中、低表示,这样如果不统一则会造成压力不稳,影响测定结果。一般地,数字2等于低,5为中,9为高。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam33进行EPI试验,CES需要填上15V,意味着20,35,50V三种CE各采集一张EPI,平均后得到一张EPI谱。为了不丢失信息,可选高扫描速度,如4000Da/S,如为了得到高质量的EPI谱,可以选1000Da/s。2020/3/1ABSCIEXMarketingteam34•检查dependentscans的设置,点击左边的EPI实验。注意当采用
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