充分发挥QTRA扫描功能在代谢物检测和鉴定以及中药成分分析中的应用----实验方法的设计和策略

司丹丹ABSCIEX亚太区应用支持中心充分发挥QTRAP扫描功能在代谢物检测和鉴定以及中药成分分析中的应用—实验方法的设计和策略，仪器操作的要点和技巧2©2011ABSCIEX主要内容QTRAP系列质谱仪扫描功能QTRAP系列质谱仪IDA工作模式建立QTRAP系列质谱在中药研究中的应用–中药活性成分定性、定量研究–中药总结三重四极杆串联质谱QTRAP系统:新一代串联质谱技术线性离子阱质谱IonTrapQQQQTRAPQTRAP®系统离子通路−Q3functionsasbothaquadrupoleandaniontrap−Fulltriplequadrupolefunctionspluslineariontrap−QTRAP®4500/5500/6500hasfasterQqQ&LITscanspeedIontrapMS4000QTRAP®QTRAP®4500/5500/6500Q0Q0QTRAP®System用于中药研究的四级杆扫描方式•高选择、高灵敏的MRM/MIM–预测目标成分或代谢物的离子对信息•半选择性的Prec/NL–化合物结构依赖性的扫描scanPrecursorIonfilterProductIonPrecursorIonScanscanQ1andQ3withconstantmassoff-setNeutralLossScan找到具有相同子离子的所有母离子找到具有相同母—子质量差的母离子四级杆扫描方式——选择性的MRM/MIMProductionfixedFragmentationMRMPrecursorionfixedPrecursorionfixedMIMQ1Q2Q3PrecursorionfixedMinimalFragmentationMIM（MultipleIonMonitoring）法与MRM（MultipleReactionMonitoring）类似，不需要知道二级碎裂的信息，但却具有与MRM相当的灵敏度和选择性QTRAP®System用于中药研究的离子阱扫描模式•增强型的MS1扫描–EnhancedMS(EMS)•快速获取高浓度的化合物信息–EnhancedResolution(ER)•获得可靠的质量数和同位素辨识信息•增强型的MS2扫描–EnhancedProductIon(EPI)•获得优于(MS2)扫描的高质量二级谱图•孙离子MS3扫描–MS/MS/MS(MS3)•对母药的碎片进行结构归属线性离子阱工作原理•打开入口，关闭出口，允许离子阱捕集离子；•关闭入口出口，阱集离子；•打开出口扫描离子QTRAP®扫描模式增强质谱扫描（EMS）1.Q1和Q2允许一定质荷比范围的离子通过2.所有通过的离子在LIT中阱集3.LIT做质谱扫描Q0Q1Q2Q1Q2LITRFonlyRFonlyCAD=highIQ3EXB离子阱集激活扫描增强分辨率扫描(ER)1.Q1选择的离子在+/-15amu窗口被传输到Q22.离子被传输通过Q2（RFonly）3.离子在LIT中捕获4.在离子在窄的质量范围，以250amu/sec扫描速度扫描出LITM+/-15amuRFonlyCAD=highTrapionsExciteScan@250amu/secQ0Q1Q2Q1Q2LITIQ3EXBResolutionatSlowerScanspeed(50Da/sor250Da/s）4000amu/sec1000amu/sec250amu/sec0.7amu0.40amu0.20amuER扫描对于IDA中触发可靠质量数的高质量二级扫描有积极的作用12©2011ABSCIEXQ0Q1Q2Q3增强子离子扫描EPI更高灵敏度的定性功能N2CADGaslineariontrap3x10-5TorrPrecursorionselectionIonaccumulationFragmentationExitlensStepsMS2:123&41.Q1中选择母离子2.在Q2中碎裂，QQQ碎裂模式3.碎片离子在Q3中捕获、富集4.质量扫描5.同时离子也在Q0捕获、富集6.多重EPI扫描可检测共流出的化合物EPI扫描功能的优势−FastScanSpeed(10000Da/sor20000Da/s)−Shortdutycycletime−Highthroughputandrichinformation•Parentisolationandfragmentationaredecoupledfromtrapping–Muchmoresensitivethanaquadrupoleproductionscan–No1/3masscut-off•Standardcollisioncellforfragmentation–Higherenergyfragments–Canalsovarycollisionenergy(CES)duringEPIscantogetricherfragmentationCE=-25CES=15CE=-10,-25,&-40overlaidandsummedCollisionEnergySpread(CES)versus3Scans无1/3的质量歧视效应Selectionof1stprecursorioninQ1FragmentationinQ2ProductionstrappedinQ3(LinearIonTrap–LIT)Isolationof2ndprecursorioninLITFragmentationinLIT2ndgenerationofproductionsscannedoutMRM3扫描功能比MRM更高选择性的定量方法定量测定血浆中的艾塞那肽MRMvs.MRM3•MRMwasnotselectiveenoughandsufferedfromlargeinterferencesinplasma•MRM3completelyeliminatedtheinterferencesandimprovedboththeLOQandthelinearityYanXuetal,“QuantitationofExenatideinHumanPlasmaUsingLC-MS/MS/MSonaLinearQTRAP5500System”MedpaceBioanalyticalLaboratories,APA2009PosterMRM838396MRM3838396202QTRAP分析三萜皂苷类化合物的裂解规律MS1EPIMS3MS3MS3MS3辅助结构解析Q0TrappingIncreasesSensitivityforMS3&EPIQ0trappingcannotworkwithDynamicFillTime,neverusedforEMSIDA工作模式建立InformationDependentAcquisition20©2011ABSCIEX线性离子阱模式三重四极杆/离子阱模式AddtoExclusionListMRMPreNLEMSEPIIDACriteria增强子离子扫描（EPI）定性•MRM,PREC,EMS,NL,EMC扫描可作为IDA预扫描:•PREC,EMS,NL扫描可以发现特征离子，并同时触发EPI扫描，在线采集MS/MS图谱用于确证、结构分析•MRM的高选择性和高灵敏度，用于定量，并同时在线触发EPI扫描，用于确证•MRM数据仍能用于定量发现和确证、结构分析一次完成…QTRAP独有的IDA工作模式InformationDependentAcquisition,信息相关采集21©2011ABSCIEX51.451.651.852.052.252.452.652.853.053.253.453.6Time,min5.0e51.0e61.5e62.0e62.5e63.0e63.5e64.0e64.5e65.0e65.5e66.0e66.5e66.8e6Intensity,cps0.0选择背景区域（当前谱图之前的三幅）当前谱图峰选择区域自动排除区域智能化的动态背景扣除(DBS)：排除噪音及共流出组分,保证低水平化合物的MS/MS图谱采集22©2011ABSCIEXDBS功能TriggerMS/MS扫描提高IDA效率MS2MS2m/z453XICm/z467XICm/z453与m/z467两组分共流出，响应强度差10倍，在DBS的作用下，均采集到质量较好的MS2。DBS保证共流出组分均能采集到二级质谱。23©2011ABSCIEXIDA信息相关扫描方式（InformationDependentAcquisition）IDA的几种混合扫描方式MRM-IDA-EPI高灵敏度的筛查和同时定性定量等NL/PREC-IDA-EPI杂质和降解物，中药天然产物的定性EMS/MIM-IDA-EPI未知物定性，例如药物代谢物、药物杂质和降解物、天然产物鉴定24©2011ABSCIEXIDA方法的建立建立方法可以通过“BuildAcquisitionMethod”或“IDAMethodWizard”通过IDA方法向导建立方法，根据说明一步一步进行。采集方法编辑方法需要用于添加和设置需要进行的试验25©2011ABSCIEXIDA向导的设定用户选择要进行的实验类型，包括预实验扫描和关联性的扫描可选择ER扫描得到精确m/z电荷状态选择MS3产生另外的关联扫描选择动态填充时间26©2011ABSCIEX实现方法12327©2011ABSCIEX12选择手动输入MRM离子对28©2011ABSCIEX可以按照文献资料中的MRM数据输入，Analyst1.5最多可以1250对（采用sMRM），小分子不使用自动CE1229©2011ABSCIEX如图设定是同一母离子按照20，35V两种不同能量得到2个EPI图Monitor可以选择1-8个，每次对最强的1-8个离母子进行MS/MS。如下所示，在窗口上方设定，建议不要超过3个，通常选1个12330©2011ABSCIEXEPI实验的碰撞能量（CE）可以通过两种不同的方式设定。选择的每一个母离子可以至多有三个不连续的碰撞能量。例如，如果两个最强的离子被选择，两个不连续的碰撞能量被设定，那么在每次循环中将进行4个独立的EPI扫描，分别为两个母离子不同CE的EPI谱。如果仪器是3200Q以下，建议Monitor选一个，EPI也选一个，并采用CES，如果是4000Q以上，则可以选3个EPI。质量范围不必太宽，最低50amu，最高比最大母离子高10个amu足够。每对MRM可以分别设DP和CE，EPI只能取平均DP，CE与数据库中一致。如果设定Monitor2个母离子按照同样20V能量，最后图谱中得到2张EPI图经验31©2011ABSCIEX通常用MRM-EPI可以将阈值设为数百CPS，若全扫描-EPI，则要数万以上。ExcludeFormerTargetIons标准可以排除已经做过MS/MS的离子。32©2011ABSCIEX选择Always可以将这些离子从剩余的运行中排除选择For_(sec)，可以排除在设定的时间窗口洗脱的母离子不再进行MS/MS扫描选择Never打勾，动态排除关闭选择After_occurrences，允许选择离子在排除之前进行几次MS/MS扫描。此处输入1，则离子在排除之前进行多于一次MS/MS扫描。如果不打勾，则与输入0是一样的，只做一次EPI。33©2011ABSCIEX建立好IDA方法后，IDACriteria里面的参数还可以修改，Select1to2表示2个最强的母离子每个做一次EPI，如果1to1则2个EPI可以是同一母离子而CE不同；右上角动态背景扣除应该打勾；MassTolerance只对EMS、prec、NL等全扫描模式起作用，MRM不必理会34©2011ABSCIEXInclusion/Exclusionlist可以设定必须采集EPI的母离子和明确知