第二章--生物细胞培养基制备设备

第二章生物细胞培养基制备设备培养基：培养基是指供特定的微生物、动物细胞、植物细胞、微藻生物等进行生长、繁殖、代谢和合成产物需要的，按一定组成比例配制而成的营养物质。培养基分类：天然培养基——成分复杂、不明确，要有质量指标合成培养基——由完全明确的化学成分的物质配制组成复合培养基（半合成培养基）——天然＋合成｛工业化生产用培养基制备工艺过程：原料→筛选→粉碎→糊化（蒸煮、酶）→糖化（酶法）→灭菌→冷却工业化大生产所用原料：1.直接使用淀粉(或淀粉的加工品，如各种淀粉糖)或糖蜜（制糖工业的下脚料）为原料。2.以初级粮食为原料(淀粉质原料)，如玉米、大米、瓜干、苕干、大麦等，需要对原料进行预处理(包括筛选、除杂和粉碎)。第一节淀粉质原料的蒸煮与糖化淀粉质原料蒸煮糖化的目的：是通过液化酶、糖化酶将蒸煮后糊化的淀粉、糊精进行水解。糖化的作用也就是把溶解状态的淀粉、糊精转化为能够被生物细胞利用的可发酵性物质（如葡萄糖、麦芽糖等），并降低醪液的粘度，有利于微生物的发酵和发酵液的输送。1、间歇蒸煮设备锥形蒸煮锅，又称亨茨锅（德国）。45738图2-21锥形蒸煮锅1-加料口2-排汽阀3-锅耳4-取样器5-加热蒸汽管6-排醪管7-衬套8-压力表216间歇蒸煮和糖化是陈旧的方法，现生产企业已基本不使用，实现了连续蒸煮糖化工艺。（一）间歇蒸煮2、间歇蒸煮工艺加水（入蒸煮锅）→投料（加液化酶）→升温→蒸煮→吹醪（二）间歇糖化间歇糖化法的工艺：蒸煮醪→糖化锅＋加水＋冷却（120℃~60℃）＋加酸十加曲十糖化十冷却（60→30℃）→发酵罐（或酒母罐）间歇糖化设备二、连续蒸煮糖化96213578蒸煮废气去发酵罐10冷水4图2-12连续糖化工艺工程1-后熟罐2-真空罐3-混合冷凝器4-水密封池5-真空蒸发罐6-糖化锅7-硫酸罐8-液曲罐9-转料泵10-喷淋冷却器1、罐式连续蒸煮1-粉浆罐2-粉浆泵3-蒸煮罐4-后熟器5-最后一个后熟器(汽液分离器)6-真空冷却器7-连续糖化锅8-液体曲罐9-糖化醪泵10-喷淋冷却器11-混合冷凝器12-水力喷射泵13-热水箱蒸煮罐图2-13蒸煮罐1-粉浆入口2-加热蒸汽管3-糊化醪出口4-安全阀接口5-压力表6-制液体曲醪出口7-罐耳8-温度计测温口9-人孔3215468791-粉浆罐2-粉浆泵3-加热器4-缓冲罐5-柱子6-1号后熟器7-2号后熟器8-汽液分离器2、.柱式连续蒸煮2010图2-17管式连续蒸煮设备流程图1817161911761512131412895431-输送机2-斗式提升机3-贮料斗4-锤式粉碎机5-螺旋输送机6-粉浆罐7-泵8-预热锅9-近料控制阀10-过滤器11-泥浆泵12-单向阀13-三套管加热器14-蒸煮管道15-压力控制阀16-后熟器17-蒸汽分离器18-真空冷凝器19-蒸汽冷凝器20-糖化锅3、管式连续蒸煮加热器喷射加热器图2-16加热器粉浆粉浆蒸汽蒸汽套管加热器最后一个后熟器（汽液分离器）图2-14最后一个后熟器（气液分离器）1-糊化醪入口2-糊化醪出口3-耳架4-自控液位仪表接口5-压力表6-二次蒸汽进口7-人孔8-安全线9-液位指示器8756493412糊化醪4、真空冷却器123至糖化锅蒸汽空气混合气体料液冷水图2-18真空冷却器1-真空冷却器2-膜式塔3-喷射器5、糖化罐（锅）图2-19连续糖化罐糊化醪进管2-水和液体曲或曲乳或糖化酶进入3-无菌压缩空气管4-人孔5-温度计测温口6-杀菌蒸汽进口管7-糖化醪出口8-搅拌器糊化醪无菌压缩空气糖化醪124835676图2-20真空糖化装置142389Aabcdefga汽液分离器（最后个后热器）b-糖化曲液计量罐c-真空糖化罐d-冷凝器e-三级真空冷却器f-三级冷凝器g-糖化醪泵1，2，8-阀3，4，6，7，9-控制阀及管5-测温管符合糖化的真空糖化器最小容积应使糖化醪在真空糖化罐内平均停留时间为20min（连续糖化采用40-45min或更长的时间），然后进入三级真空冷却的第一室。真空糖化器的优点：既是蒸发冷却器，又是糖化器，简化了设备。第二节纤维素和半纤维素的水解直接发酵纤维素酶纤维素类物质纤维素木糖木质素葡萄糖水解配制木酮糖异构化木糖异构酶配制配制作为生物细胞培养成分木质纤维素发酵生产糖类的路线影响植物纤维资源充分利用的主要难题之一是木质纤维素材料通常难于被降解转化。这就需要采用预处理措施，使木质纤维素的结构能适于随后的酶降解。预处理的主要作用就是要改变天然纤维的结晶度、脱去木质素或半纤维素，增加酶与纤维素的可接触面积，从而提高酶解的效率。一、蒸汽爆裂法在众多预处理方法中，高压蒸汽爆碎技术是比较有效、低成本、无污染的新技术。向装有植物纤维物质的压力罐通入高压蒸汽，使罐温度达到200~240℃左右，原料中的半纤维素会迅速分解释放出有机酸，发生自水解作用而可溶化。细胞间的木质素熔化，并发生部分降解，变得易为热水、有机溶剂或稀碱抽提。加上突然减压爆碎的机械分离作用，使植物细胞间质或细胞壁变疏松，细胞游离，纤维素的可酶解性明显增强。蒸汽爆碎技术的成败在于精确控制处理强度（蒸汽温度和处理时间）和处理的均匀度。控制不当，半纤维素等未充分降解或降解产生的单糖被进一步降解破坏，得糖率往往会低于理论值的65%。热压器沸腾器控制点水份控制器冲子同轴喷射器喷射器进料处收料器排阀器图2-27蔗渣蒸汽裂解膨化流程示意图二、稀酸预处理法半纤维素和纤维素都能被强酸直接降解成单糖。纤维素的酸水解工艺比较简单，已有工业化经验。但是需要较高的温度和较大量的酸，水解产生的单糖会进一步降解，产生对微生物有毒性的糠醛类物质。处理后的糖液需要中和、脱毒等后处理后才能用于发酵。纤维原料稀酸水解稀酸加压水解稀酸常压水解分段水解法固定水解法渗滤水解法常用的稀酸水解方法42356图2-25木材连续渗滤水解流程水解液往中和器低压二次蒸气高压二次蒸气高压热水蒸汽排木质素加料1-水解器2-物料贮器3-计量器4-往复泵5-高压蒸发器6-低压蒸发器7-排渣器三、酸酶水解法蔗渣预处理爆破膨化（或碱煮）酶解反应器内切木聚糖酶低聚木糖液清净真空浓缩低聚木糖浆酶解渣多级串联水解六碳糖液连续发酵酒精水解残渣（燃料、肥料或填料）粗馏精馏脱水无水酒精酸0123456234567回转炉（热压器）螺旋喂料器蔗渣酸液混合器螺旋喂料器热水抽提系统（渗出器）筛网水螺旋压榨机17-20%糖溶液残渣图2-28螺旋连续水解器第三节糖蜜原料的稀释与澄清糖蜜是制糖厂的一种副产品，里面含有大量的可发酵性糖，这些糖分在目前制糖工业技术或经济核算上已不能或不宜用结晶方法加以回收。糖蜜是一种非结晶糖分，因其本身就含有相当数量的可发酵性糖，无需糖化，因此是微生物工业大规模发酵生产酒精、甘油、丙酮丁醇、柠檬酸、谷氨酸、食用酵母及液态饲料等的良好原料。由于原糖蜜的浓度一般都在80°Bx以上，胶体物质与灰分多，产酸细菌多，所以糖蜜酒精发酵前需进行稀释、酸化、灭菌、澄清等处理过程。一、糖蜜稀释器（一）水平式糖蜜稀释器（马尔钦科式连续式稀释器）该稀释器为一只圆筒形的管子，顺着管长装有若干孔板式的隔板和一块筛板，为了使糖蜜与水更好地混合，各板上的孔位都是交错配置，即一个孔在上部，一个孔在下部，这样使液体在流动过程中，呈湍流式运动。隔板固定在一对水平轴上，能与轴一道拆卸，以便清洗。稀释器安装时通常出口的一端向下倾斜，这种稀释器的混合效果较好，同时也节省动力。图2-29水平式糖蜜连续稀释器糖密入口热水营养盐类酒精液体冷水糖蜜出口432143214-4切面3-3切面2-2切面1-1切面（二）立式糖蜜连续稀释器图2-30立式糖蜜连续稀释器1-隔板2-固定杆糖蜜出口AA12糖蜜冷水热水A-A图2-31错板式连续稀释器图2-32胀缩式连续稀释器官图2-33变管径式连续稀释器蒸汽糖蜜水营养液糖液糖液糖液糖蜜水蒸汽营养液营养液蒸汽水糖蜜（三）间歇式稀释设备间歇式的糖蜜稀释器通常是一个敞口的容器，内安有搅拌装置或用通风代替搅拌以使糖蜜与水能达均匀稀释。稀释器可由钢板制成，也可是水泥池。常用的间歇稀释器的容积一般为5~20m3，应根据各厂的生产任务而定。二、糖蜜原料的澄清糖蜜原料的澄清的目的是使原料中的灰渣等固形物沉淀，同时进行灭菌，以达到发酵的要求。对于固体含量少[0.1%（v/v）〉]，颗粒直径在5~100μm的悬浮液，在过滤时难以形成滤饼，就要采用澄清过滤。糖蜜原料的澄清方法有以下几种：1．加酸通用处理法2．加热加酸沉淀法3．絮凝剂澄清处理法酸化澄清设备——澄清罐国内大多数糖蜜酒精厂只考虑对用作酒母的稀糖液进行澄清处理，而对基本糖液则不经澄清处理，这样可大大简化生产，提高效率，酒精发酵生产也不会受影响。第四节液体培养基的灭菌灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法大致有以下几种：化学灭菌法电磁波、射线灭菌法干热灭菌法湿热灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法杂菌污染产生的各种不良后果：（1）由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；（2）由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；（3）杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；（4）杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败等等。常用的灭菌方法：（1）化学灭菌——采用化学试剂，如：甲醛、新洁尔灭、漂白粉、环氧乙烷等。甲醛用于无菌室内熏蒸（5ml/m3）；新洁尔灭（1‰）用于桌椅地板、实验用具的消毒；漂白粉（3～5％）用于车间内外环境杀菌；环氧乙烷（1％体积比）用于塑料培养器皿灭菌。（2）射线灭菌——采用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射进行灭菌，如：紫外线（波长≤313nm）、γ射线等。紫外线用于空气及物体表面灭菌；γ射线用于塑料制品灭菌。（3）干热灭菌——采用电热鼓风烘箱，灭菌对象为玻璃器皿、移液管、接种针等，温度160℃，保温1～2hr。（4）湿热灭菌——直接用高压蒸汽对物料或设备容器的灭菌，温度115～140℃，保温20～30min。高压蒸汽的优点为穿透力强、无毒、无有害残留物、廉价等，在工业生产中广泛应用。（5）过滤灭（除）菌——指利用微孔≤0.22μm的滤膜过滤截留微生物的方法。应用于含有热敏性营养物质的培养基，如：大多数的动、植物培养基。工业生产所用的培养基、发酵设备一般都采用蒸汽湿热灭菌。一、湿热灭菌原理和影响灭菌的因素对数残留定律0012.303lnlgttNNtKNKN0NtN式中——开始灭菌（t=0）时原有活菌数；——经时间t后残存活菌数。K——灭菌速度常数（s-1）图2-1大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线t(min)-5-4-3-2-1101010101054℃56℃60℃58℃8641020温度对死亡速率的影响4.03.02.00.10.20.40.60.81.02.642.622.602.582.562.54斜率=-ΔE/R微生物死亡与温度的关系在灭菌时，温度T和时间t是两个重要参数，一般而言，提高温度或者延长时间，均可增加对杂菌的杀灭。生产实践证明，灭菌温度较高而时间较短比温度较低而时间较长要好。据此，可以在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。二、连续灭菌流程及设备培养基的连续灭菌，就是将配好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。时间(min)温度图2-3培养基连续灭菌过程中温度的变化20s20s2-3min144℃27℃连续灭菌具有如下的优点：（1）提高产量。与分批灭菌相比培养液受热时间短，可缩短发酵周期，同时培养基成分破坏较少。（2）产品质量较易控制。（3）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。（4）适宜采用自动控制。（5）降低劳动强度。在连续灭菌过程中，蒸汽用量虽平稳，但气压一般要求高于0.5Mpa（表压）。连消设备比较复杂，投资较大。采用连续灭菌时