液相色谱方法开发与应用培训班基础知识

1ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited岛津液相色谱方法开发与应用培训---液相色谱基础知识岛津国际贸易（上海）有限公司分析仪器事业部分析中心2ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited免费咨询电话800-810-0439400-650-0439维修部010-85252375（北京）021-22013601（上海）020-87108631（广州）分析中心021-22013645（上海）零配件订购010-85252353（北京）021-62800202（岛津技迩）(Shanghai)Co.Limited1969GPC系统开发1972LC-1（LC-830）销售＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞1978LC-3A系列销售＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞1981LC-4A系列销售＜内置微型计算机的全自动HPLC＞1982LC-5A系列销售＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞1984LC-6A系列销售＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞1991LC-10A系列销售＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞1997LC-VP系列销售＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞2000LC-2010销售＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞2004LC-20AProminence销售＜为分析实验室带来革新的HPLC＞2006ProminenceUFLC利用常规HPLC实现超快速分析2008ProminenceUFLCXR超快速、高分离度实现高通量分析2010LC-30ANexeraUHPLC超高效液相色谱岛津HPLC的历史Startedin19691997THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexibleHPLCSystemwithMicro-strokeVolumeSolventDeliveryUnitLC-VP2000THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20102004THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20AProminence4ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited岛津UFLC遍布五大洲交付波兰南极基地使用的岛津分析装置（摄影：ArturDzieniszewski）5ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.LimitedLC-20AProminence6ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited液相色谱分离原理液固（吸附）色谱液液（分配）色谱正相色谱反相色谱键合相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱空间排斥色谱亲和色谱液相色谱分类7ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited吸附色谱分离机理：化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸附吸附色谱固定相极性酸性（硅胶）碱性（氧化镁、硅酸镁分子筛、三氧化二铝等）非极性（活性炭）8ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited流动相常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大。注意：不能使用含水的流动相，因为硅胶遇水会失活。（微量水可改善拖尾状况，有时用水作减尾剂）吸附色谱9ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分离物质对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离，例如油品、脂肪、芳烃等对具有不同极性取代基的化合物或异构体有较好的选择性但对于强极性或离子型的化合物会产生不可逆吸附。对同系物分离能力较差优点：样品负载能力大稳定性好（pH＝3-8）吸附色谱10ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited液液分配色谱固定相：惰性载体上机械涂布固定液固定液容易流失，导致保留值减小，柱效下降。化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相11ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited键合相色谱－正相液相色谱正相液相色谱流动相极性小于固定相极性分离机制：范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力。固定相：键合的胺基（-NH2)、腈基（-CN)、醚基（-O-）等氢键力：胺基腈基芳硝基二醇基醚基流动相：常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大分离物质：不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC12ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited胺基柱：极性强，具有碱性。可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂，分离酚、羧酸、核苷酸。与糖分子中的羟基作用，可分离单糖、二糖、多糖。注意：胺基柱不能分析含有羰基的化合物（如醛、酮、还原糖等，流动相不能用丙酮）键合相色谱－正相液相色谱13ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited腈基柱：中等极性，分离选择性与硅胶类似，但保留值比硅胶低。对酸性、碱性样品可获得对称峰。对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分离能力。芳硝基柱：弱极性对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性键合相色谱－正相液相色谱14ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited二醇基柱：弱极性可分离有机酸及其共聚物。也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相醚基柱：弱极性可分离能形成氢键的化合物，如酚类和硝基化合物也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相键合相色谱－正相液相色谱15ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited反相液相色谱流动相极性大于固定相极性分离机制：疏水性键合相色谱－反相液相色谱16ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited反相液相色谱固定相：键合的烷基或苯基等非极性固定相流动相：水、有机溶剂、缓冲液键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值增大流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强，溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质保留值越大。溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。键合相色谱－反相液相色谱17ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分离物质：能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物烷基柱（C8、C18）可分离中等极性的化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷、核苷酸、极性合成药物等苯基柱（-C6H5)：可分离非极性至中等极性的化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生化氨基酸等。键合相色谱－反相液相色谱18ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited1、稳定性正相键合相的稳定性要小于反相键合相反相键合相使用pH为2-8，pH8.5会引起基体硅胶溶解2、重现性同一种类型的键合相，因厂家不同、、生产批号不同，会表现不同的分离特性，表现为重复性差3、键合相色谱柱的再生吸附、缔合等作用使柱效降低正相色谱柱再生：1:1甲醇-氯仿反相色谱柱再生：甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、0.01mol/L无机酸（硫酸pH2）键合相色谱－键合相使用的注意点19ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited键合相色谱－流动相的选择质子接受体质子给予体偶极化合物甲醇乙腈THF乙醚CHCl3CH2Cl2正相色谱反相色谱水正相、反相色谱中溶剂选择性示意图20ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。关于离子对色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种机理：离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。键合相色谱－离子对色谱21ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited常用离子对试剂•季铵盐•叔胺•烷基磺酸盐•高氯酸•烷基硫酸盐键合相色谱－离子对色谱22ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited•分析对象有机酸、碱、盐离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物药物分析如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素、维生素键合相色谱－离子对色谱23ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited影响离子对色谱分离选择性的因素1、溶剂的极性2、离子强度（反相色谱中，离子强度增加，溶质k’值降低；正相色谱中，离子强度增加，溶质k’值增加）3、pH值（反相色谱中，pH值降低，阴离子溶质k’值降低；正相色谱中，pH值增加，阴离子溶质k’值增加）4、温度5、离子对试剂的性质和浓度的影响键合相色谱－离子对色谱24ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited•离子抑制色谱通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐和醋酸盐），调节流动相的pH值，增加组分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。键合相色谱－离子抑制色谱25ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited影响离子抑制色谱分离选择性的因素1、pH值（对于弱酸，pHpK值时，组分以分子形式存在，k值增大；pHpK值时，组分以离子形式存在，k值减小。对于弱碱，情况相反）2、温度3、离子抑制试剂的性质和浓度的影响键合相色谱－离子抑制色谱26ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分离对象适合于3.0pKa7.0的弱酸、7.0pKa8.0的弱碱以及两性化合物的分离对于pKa3.0的酸和pKa8.0的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法离子抑制色谱缺点是重复性较差键合相色谱－离子抑制色谱27ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited键合相色谱－离子对色谱和离子抑制色谱的区别1、添加物质不同离子抑制色谱法向流动相中添加抑制剂抑制自身解离。所添加的抑制剂为低分子有机或无机弱酸、弱碱、盐。抑制离子为样品本身具有的离子。离子对色谱法是向流动相中加入离子对试剂。离子对试剂为有机两性化合物、表面活性剂。2、分析对象不同离子抑制色谱法适于分离弱酸、弱碱、有机盐；两性化合物；弱酸、弱碱与分子化合物共存时的分离离子对色谱法用于有机强酸、碱的分离28ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子交换色谱法此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，应用范围较广29ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited1．离子交换原理离子