文献汇报

PDL1在I型糖尿病患者的胰岛上表达并被α和γ干扰素通过IRF1途径诱导上调表达PDL1isexpressedintheisletsofpeoplewithtype1diabetesandisup-regulatedbyinterferons-αand-γviaIRF1induction汇报人：李民IF=6.183本文的研究要素：疾病：I型糖尿病表型：胰岛细胞上表达PDL-1变量：I型和II型干扰素通路：JAK/STAT-IRF1通路汇报内容一、研究背景二、研究目的和内容三、材料和方法四、实验结果五、实验结论六、学习体会一、研究背景1、1型糖尿病（type1diabetes）糖尿病是以慢性高血糖为特征，以糖脂代谢紊乱为主要表现的一组代谢性疾病。各种不同原因均可造成胰岛β细胞分泌胰岛素绝对或相对不足，周围组织细胞对胰岛素的生物效应出现抵抗或耐受，从而导致血糖升高。临床上主要分为1型糖尿病和2型糖尿病两大类，T1DM是由于自身免疫系统错误地攻击和损伤胰岛β细胞，致使胰岛素合成和分泌减少或缺乏引起的自身免疫性疾病，多发生于儿童和青少年。T1DM的基本特征为，患者起病急剧，体内胰岛素绝对不足，易发生酮症酸中毒。特点：细胞免疫和体液免疫因子参与疾病的病理过程2、免疫检查点抑制剂（immunecheckpointinhibitors）肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。近期伴随诺贝尔生理学或医学奖的颁发，PD-1、CTLA-4等作为免疫系统“刹车”的免疫检查点分子一时间家喻户晓，治疗癌症未来可期！而上述俩分子，真是让人又爱又恨。所爱者无外乎它俩能守免疫之平衡，可阻止淋巴细胞意外暴走，以免伤己伤身；而所恨者无疑就在于它俩心志不坚，稍不留神就给了肿瘤可乘之机，在被特异性配体（如肿瘤的PD-1L）成功洗脑后，就误上了贼船。针对免疫检查点治疗，重启并维持肿瘤-免疫循环意义非凡。目前，针对免疫检查点研制的抑制剂已经在临床应用，并取得了一定的疗效。CTLA4、PD-L1作用机制示意图PD-1:程序性死亡受体-1；PDL-1:程序性死亡受体-1配体。CTLA-4：细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，又名CD152。肿瘤细胞结合PD1导致免疫逃逸抗PD1抗体结合PD1后T细胞发挥杀伤肿瘤细胞作用（注：图片转自解螺旋）3、JAK/STAT-IRF1通路酪氨酸激酶(januskinase,JAK)/信号转导子和转录激活子(signaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)(JAK/STAT)信号通道涉及细胞分化、增殖、凋亡及免疫调节等病理生理过程,与癌症、支气管哮喘、心血管疾病、糖尿病等多种疾病密切相关,是传导细胞因子刺激信号的基本途径之一。JAK包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2；STAT包括7个成员:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。干扰素调节因子（IRF1），作为重要的核转录调节因子，最初被发现可以调节型干扰素的产生。进一步研究发现，参与了多种细胞过程的调控，包括细胞增殖、抗肿瘤和抗病毒反应以及免疫炎症反应顺序为：JAKSTATIRF14、相关的前期研究结果①肿瘤细胞上的PDL-1主要是被IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、TGF-β和TNF-α等几种促炎干扰素刺激表达；②JAK/STAT-IRF-1途径是干扰素介导黑色素瘤细胞表达PDL-1的关键调节因子；③在遗传高风险发展成I型糖尿病的儿童血液中，I型干扰素先于自身免疫启动前发展；④I型干扰素中的IFN-α表达于I型糖尿病患者的胰岛上。⑤动物模型证实抑制PD-1或PDL1可加速1型糖尿病发生，且模型动物胰岛B细胞上过表达PDL-1分子尽管免疫检查点抑制剂治疗重燃了肿瘤免疫疗法的希望，但与其他癌症治疗方法相似，该疗法也是有其副作用的，如迟发反应以及疗效受限等，有时甚至可能危及生命，因为过度活跃的免疫反应也会引发或加速严重的自身免疫反应的。据报道接受免疫检查点抑制剂治疗的病人中有15%的人罹患内分泌自身免疫病，包括1型糖尿病；。然而PDL-1是否在1型糖尿病病人的胰岛细胞上表达是不清楚的，如果表达其表达调控机制又是什么？二、研究目的和内容研究目的：1、探索1型糖尿病患者胰岛B细胞上是否表达PDL-1分子？2、探索哪些干扰素可以诱导胰岛表达PDL-1，及证明干扰素是否主要通过JAK/STAT-IRF1途径诱导PDL-1表达？3、补充说明1型糖尿病的发病机制以及为更好应用免疫检查点抑制剂提供新的靶标和思路。研究内容T1DM患者和对照组胰岛切片免疫组化技术胰岛细胞PDL-1表达与否EndoC-βH1细胞系、人胰岛细胞原代培养细胞系探索哪些干扰素可以诱导PDL-1表达干扰素处理证实JAK/STAT-IRF1诱导途径药物处理或沉默表达表型检测体外实验（invitro）1、材料来源：12例1型糖尿病患者和6例非糖尿病患者胰脏切片来自埃克塞特糖尿病档案生物库或DiViD活检组织。2、方法：①免疫组织化学检测标本PDL-1、胰岛素和胰高血糖素的表达；②RT-PCR、流式细胞仪和免疫印迹杂交用来检测细胞因子诱导人类胰岛B细胞系、EndoC-βH1细胞系和人胰岛细胞的PDL-1、胰岛素的表达；③预先证明的特异siRNA用来沉默STAT1、STAT2、IRF1和JAK1信号通路；④使用JAK抑制剂Ruxolitinib来证实关键的步骤；⑤使用6.0版本的GraphPadPrism程序进行数据分析。三、材料和方法1、PDL-1在1型糖尿病患者含有胰岛素的胰岛细胞表达升高，在非糖尿病胰岛及胰岛素缺失胰岛无表达或低表达。四、实验结果2、干扰素是人类胰岛B细胞表达PDL1的主要调节因子，其中α和γ干扰素起作用、干扰素-1β无作用。展示经干扰素处理EndoC-βH1细胞系的RT-PCR、WB和流式细胞检测部分结果3、抑制JAK1的活性降低α干扰素诱导PDL1表达的效能。4、α干扰素诱导PDL1表达只需要STAT1、STAT2两者之一具有活性即可。5、IRF1作为STAT1、STAT2的下游转录激活因子，在α干扰素诱导PDL1表达中具有重要作用。一、证实了1型糖尿病患者胰岛B细胞上表达PDL-1分子；胰岛B细胞上的PDL1分子有助于减轻免疫攻击，表达PDL1的胰岛细胞可能生存更长久；二、证明了α和γ干扰素可以并主要通过JAK/STAT-IRF1途径诱导PDL-1表达；三、发现单独沉默STAT1或STAT2不能阻断干扰素诱导PDL1表达，只有同时沉默二者才能起到阻断作用，这与它们在癌细胞中的作用不同，可能成为治疗癌症同时不引起自身免疫病的靶点；四、免疫检查点抑制剂治疗可能阻断PDL1对胰岛的保护作用，加速胰岛细胞的丢失和1型糖尿病的形成；五、α干扰素既可以诱发胰岛炎症损伤β细胞，也可以诱导表达PDL-1减轻炎症,其发生的时序不同，进一步明确时间节点有助于临床相应药物的应用。五、实验结论六、学习体会1、本文只有组织表达和细胞实验结果，没有动物实验结果，显得论证层次不足，实际上是已有相关的动物实验结果发表；2、本文实验设计不够严谨，如用siRNA沉默JAK/STAT-IRF1通路分子的实验中只用了EndoC-βH1细胞系一种细胞系和α干扰素一种干扰素；做了敲低而没有做过表达；也没有使用其他细胞系作为对照；3、本文提出的STAT分子在肿瘤和自身免疫作用的不同，以及α干扰素存在时序性的双重作用是可以进一步研究的；3、本文的研究思路给了我们一个提示：其他以细胞免疫为主的自身免疫病或感染性疾病是不是也有PDL-1表达参与疾病的发生和转归。免疫检查点抑制剂常见的毒性反应有结肠炎、肺炎、皮肤症状、内分泌功能减退、肝炎、心肌炎和神经毒性等。Johnson,D.B.,S.Chandra,andJ.A.Sosman,ImmuneCheckpointInhibitorToxicityin2018.JAMA,2018.320(16):p.1702-1703.