粮食中真菌毒素的检测

1粮食中真菌毒素的检测一、前言真菌是微生物中的高等生物，是一类有细胞壁，不含叶绿素，无根叶茎，以腐生或寄生方式生存，能进行有性或无性繁殖的微生物。自然界中的真菌分布十分广泛，并可作为食品中正常菌相的一部分用来加工食品，但在特定情况下又可造成食品的腐败变质。有些真菌本身不仅作为病原体引发人类疾病，其代谢产物真菌毒素(mycotoxins)也对人及动物造成危害。真菌毒素是农产品的主要污染物之一，人畜进食被其污染的粮油食品可导致急、慢性真菌毒素中毒症。1.1粮食中典型的真菌毒素1）黄曲霉毒素(aflatoxin)主要是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，黄曲霉毒素污染的发生和程度随地理和季节因素以及作物生长、收获、贮存的条件不同而异，粮油作物在收获后、贮藏期以及加工后都能受到产毒菌株污染，有时早在作物收获前就已受到了产毒菌株的污染。1960年在英格兰南部和东部地区，十几万只火鸡因食用发霉的花生粉而中毒死亡。剖检中毒死鸡，发现肝脏出血、坏死，肾肿大，病理检查发现肝实质细胞退行性病变及胆管上皮细胞增生。研究发现火鸡饲料中的花生粉含有一种荧光物质，是导致火鸡死亡的病因，并证实了该物质是黄曲霉的代谢产物，故命名为黄曲霉毒素。2）赭曲霉毒素最初是从南非的赭曲霉毒株中分离出来的，由赭曲霉(Asper-gillusochraceus)、洋葱曲霉(Aspergillusalliaceus)、鲜绿青霉(Pencilliumviridicatum)、徘徊青霉等代谢产生，包括7种结构类似的化合物，赭曲霉毒素A是其中毒性最强的物质，是自然界中的主要天然污染物。在一些国家的食品中，赭曲霉毒素A的污染率可达2％～30％。该化合物主要表现为肾脏毒性。在巴尔干地方性肾病流行区，6％～18%人群的血液中能检出赭曲霉毒素A。3）展青霉毒素(Pat)，又叫棒曲霉毒素和珊瑚青霉毒素，主要是由棒曲霉(Aspergillusclavatus)、扩展青霉(Pencilliumexpansum)、展青霉(Pencilliumpatulium)、曲青霉(Pencilliumaspergillus)等代谢产生的一种免疫抑制剂。4）单端孢霉烯族化合物是由头孢菌(ephalosporium)、镰孢菌(Fusarium)、葡萄状穗霉(Stachybotrys)和木霉菌(Trichodema)等代谢产生的一组生物活性和化学结构相似的有毒代谢产物。5）玉米赤霉烯酮(ZEA)又名F一2毒素，是由镰刀菌属的菌种产生的代谢产物。最早是由染有赤霉病的玉米中分离得到的，是由禾谷镰孢(Fusariumgra-minearum)、黄色镰孢(Fusariumculuorum)、木贼镰孢(Fusariumeqlliseli)半裸镰孢(Fusariumsemitectum)茄病镰孢(Fusariumsolani)等菌种产生的。许多国家曾报道，猪和牛等家畜摄食被玉米赤霉烯酮污染的谷物或饲料后，可引起动物雌性激素中毒症。1.2检测真菌毒素的常用方法：1）薄层层析法：TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。TLC法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，在展开时影响斑点的荧光强度。2）色谱法：2色谱法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的真菌毒素的化学分析方法。现在比较普遍的真菌毒素的分析方法还是液相色谱法，包括液相色谱-质谱联用技术。该法快速而准确，但需要昂贵的仪器设备，仅限于专业检测机构获得科研和调查分析、监测使用，未能在企业及基层广泛推广使用，而且其结果的滞后效应大大降低了对生产实际的指导效果。3）免疫化学检测法：（胶体金免疫层析法，酶联免疫吸附法）免疫学检测方法是基于抗体与抗原或半抗原之间的选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法。通常具有高的选择性和很低的检出限，广泛用于各种抗原、半抗或抗体的测定，一般可分为荧光免疫法、发光免疫法、免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，其中在饲料霉菌毒素检测中应用较广的主要是酶联免疫吸附法（ELISA）和胶体金免疫层析法。免疫学检测方法由于其快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高等特性，特别适用于饲料厂、粮油/食品加工厂、养殖场等企业进行原料或成品的检测以及工商质监部门现场检测。该类方法有以下特点：1、灵敏度高2、干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。3、操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时操作步骤也非常简便，测定时间也短。4、安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，所用试剂也相对较少，特别是因为灵敏度高，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。二、实验目的：检测入仓小麦，稻谷，大米的真菌毒素。三、实验原理1.免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为:GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。常用的免疫胶体金检测技术（1）免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2）斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜（如膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。（3）胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗3原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。2.酶联免疫吸附测定法（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（1）间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。（2）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBcELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。4四、实验材料与仪器4.1试样：小麦，大米，稻谷4.2试剂：超纯水（dH2O），甲醇4.3仪器：胶体金真菌毒素检测卡，酶联免疫试剂盒，恒温箱，酶标仪，移液枪五、实验步骤5.1胶体金检测卡定性测试真菌毒素浓度：1.入仓小麦样品经过粮食分样器分样至50g，作为待测样品。2.把待测样品经植物粉碎机研磨，过20目筛并混匀。3.准确称取1g均匀粉碎试样到15mL离心管中。4.在离心管中准确加入萃取液5mL，将瓶塞盖紧密封，用力震荡5分钟，经4000rpm离心1分钟得上清液。5．撕开真菌毒素检测试纸卡包装,取出金标微孔。用吸管取上述离心管中上清液5滴滴入金标微孔中,2分钟后用滴管将微孔中的检测液与金充分混匀,再等2分钟后,将混匀的混合液用滴管全部吸取并滴加到试纸卡的(S)加样孔中。6.5~10分钟判断结果,半小时后的结果判读无效。结果判定：1测试卡为阴性，表示样品真菌毒素浓度符合规定。2测试卡为阳性，表示样品真菌毒素浓度超过规定浓度，需要用酶联免疫法定量测定其真菌毒素浓度。5.2酶联免疫法定量测定真菌毒素浓度：1.入仓小麦样品经过粮食分样器分样至50g，把样品经植物粉碎机研磨，过20目筛并混匀。2.准确称取样品粉末1g并加于配套的离心管中,加入提取液甲醇-水（4:1）5mL。用震荡器把提取液和样品充分混匀并4000rpm离心1分钟，所得上层液体为含有检测物质的待检液。3.根据需要对待测液进行梯度稀释；4.将阴性质控、阳性质控和标准品作1：200稀释（将5μL样品加稀释液稀释到1mL，混匀）；5.取100μL已稀释的样品、标准品和阴性质控、阳性质控加入相应的孔板内（质控和标准品至少需做两孔），A1孔不加液体作为空白底色；6.在37℃温箱中放置30分钟；7.到时间后将孔被液体甩去，并用1X洗涤液反复清洗4次，最后用蒸馏水洗一次；8.在每孔内加100μL酶结合物（需按比例稀释，除A1孔外），轻微混匀；59.在37℃温箱中放置30分钟；10.甩去孔内酶结合物，用1X洗涤液反复清洗4次，最后用蒸馏水洗一次。11.在每孔内加100μLTMB（使用前混合Ａ液和Ｂ液）混匀；12.37℃放置15分钟，轻微混匀；13.每孔加50μl1N硫酸终止液，终止反应。14.在15分钟内，用酶标仪在450nm处读取吸光度值（OD值）（将酶标仪A1孔设定为空白孔）。结果换算：以标准样品的OD值为轴，标准样品的数值为X轴，在方格纸或计算机上作出标准曲线，然后根据标本的OD值读数在标准曲线上读出相应的IgG抗体浓度。6测定小麦呕吐毒素流程图备注：酶联免疫法一板可测12个样品，所以呕吐毒素大于2000pb的样品凑齐12个做一次。1000pb呕吐毒素快速卡测定小麦粉呕吐毒素测试为阴性测试为阳性1500pb呕吐毒素快速卡测定小麦粉呕吐毒素出结果测试为阴性测试为阳性出结果2000pb呕吐毒素快速卡测定小麦粉呕吐毒素测试为阴性出结果测试为阳性酶联免疫法测定小麦粉呕吐毒素出结果