米曲霉的培养及蛋白质的分析

米曲霉的培养及蛋白质的分析一、实验目的通过固态三角瓶培养曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法二、实验原理、过程和方法1、实验原理2、实验过程3、实验方法1、实验原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱类等领域广泛应用。固态培养方法：（Solidstatecultivation）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红曲及酱油米曲霉培养属散曲法；而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲，转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中；日本、台湾已大规模化，机械化。固态培养微生物：主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母菌也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率较高。我国广泛使用的厚层通风固态法培养法，空气一般不经过除菌处理，培养环境也无法做到严格无菌。故染菌问题未得到根本解决。本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征：米曲霉（Aspergillus）属曲霉菌（Aspergillus）。菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。2、实验过程米曲霉菌种的纯化（单菌落分离），制成斜面，将斜面菌种接入250ml三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养（500ml）三角瓶。米曲霉培养物经水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活力的测定。3、实验方法米曲霉的培养本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。试管斜面培养基：豆饼浸出汁：100克豆饼粉，加水500ml，浸泡4小时，煮沸3-4小时，纱布自然过滤，取液，调整至5波美度。每100ml豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氢钾0.1克，硫酸镁0.05克，硫酸铵0.05克，琼脂2克，自然pH。或采用马铃薯培养基：马铃薯200g葡萄糖20g琼脂15-20g加水至1000mlpH自然。米曲霉的培养基1：麸皮80g，面粉（或小麦粉）20g，水80ml；米曲霉的培养基2、豆粕粉10g，麸皮90g，水110ml；装料厚度：1cm左右；灭菌：120℃，30-60min；三角瓶培养基制备：接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度、湿度，装料量，基质水分含量。固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的。实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂，则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散，每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为48-70小时。三、实验仪器、设备和材料恒温培养箱或固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，计数器，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。米曲霉菌种（酱油生产用米曲霉）四、实验分析项目和方法1、米曲霉培养效果测定：米曲霉孢子计数（显微镜观察）；通常每克曲（干基）孢子数可达100亿以上；2、干物质失重的测定干重失重＝发酵前干重－发酵后干重3、米曲霉蛋白酶活力的测定3.1原理（1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈蓝色反应。（2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)。（3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计测定。（4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。3.2试剂（1）福林试剂于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。（2）0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。（3）0.4mol/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。（4）0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液。（5）2%酪蛋白溶液称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000ml即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2~3滴湿润。（6）100μg/m1酪氨酸溶液精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000μg/m1。再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。3.3操作步骤3.3.1标准曲线的绘制（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(2)测定步骤另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，在波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值．以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用10－20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.2－0.4范围内为宜)。3.3.2酶液的制备取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管，置入40℃水浴中预热3－5min。在三支平行试验管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。以空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。3.3.3测定蛋白酶活力单位定义：在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。式中：K：标准曲线中O·D值为1所相当的酪氨酸的微克数；OD：平行试验管的平均光密度；4：试管中反应液总体积(毫升)；10：反应10分钟；N：稀释倍数；W：曲的称取量(克)3.3.4计算（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂，其工作曲线K值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲线应重作。（2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。3.3.5说明五、实验报告内容和数据处理两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性变化规律。