代谢组学技术概述

代谢组学技术及其在医学研究中的应用系统生物学（systemsbiology）是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。在后基因组(post-genome)时代,系统生物学研究逐渐成为人们关注的焦点。系统生物学研究的目的是根据细胞内基因、蛋白质、代谢物以及细胞器等组分间的时空相互关系构建生物网络,了解生物行为。一些组学研究技术的发展极大地推动了系统生物学的研究,比如转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）等功能基因组学（functionalgenomics,与结构基因组学structuralgenomics相对)研究方法可同时检测药物、疾病、环境或其它因素影响下大量基因或蛋白质的表达变化情况,但这些变化往往不能与生物学功能的变化建立直接联系。代谢组学(metabonomics／metabolomics)方法则可为代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合,包含一系列不同化学型的分子,比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomics／metabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态,协助阐释新基因或未知功能基因的功能,并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性,帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究,这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。1代谢组学分析实验设计及样品制备代谢组学是一种大规模研究技术,对于研究外源性物质(药物或毒物)刺激、环境变化或遗传修饰引起的机体所有代谢物变化过程是很有效的,比如寻找疾病生物标志物用于早期诊断。但对于研究特定种类的代谢物,这种大规模研究平台的灵敏度则不如传统的技术手段。进行代谢组分析,首先需要进行样品的提取。对于组织和细胞培养液,水相和有机相代谢物可以很容易地被提取。实际上,不论各种代谢物在体内参与何种代谢过程,通过相应抽提程序,所有的胞浆以及膜代谢物均会被提取出来。样品制备过程的不一致性导致结果重复性较差。因此,为最大程度减小操作对代谢组数据产出的影响,人们应严格遵循一套标准的提取程序(StandardOperatingProtocols,SOPs)。2代谢组学化学分析技术代谢组研究需要比较复杂的分离、鉴定方法,到目前为止,应用的方法主要包括核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR)、电喷雾电离质谱(electrospraryionizationmassspectrometry,ESI-MS)、液相色谱-紫外光谱-质谱联用(liquidchromatographyultravioletmassspectrometry,LC-UV-MS)、串联质谱(tandemmassspectrometry,tandemMS)以及液相色谱-质谱联用(liquidchromatographymassspectrometry,LC-MS)等。1946年，美国哈佛大学的珀塞尔和斯坦福大学的布洛赫宣布，他们发现了核磁共振。两人因此获得了1952年诺贝尔奖。核磁共振是原子核的磁矩在恒定磁场和高频磁场（处在无线电波波段）同时作用下，当满足一定条件时，会产生共振吸收现象。核磁共振很快成为一种探索、研究物质微观结构和性质的高新技术。目前，核磁共振已在物理、化学、材料科学、生命科学和医学等领域中得到了广泛应用。核磁共振仪器组早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等，后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面。用核磁共振法进行材料成分和结构分析有精度高、对样品限制少、不破坏样品等优点。对于孤立的氢原子核（也就是质子），当磁场为1.4T时，共振频率为59.6MHz，相应的电磁波为波长5米的无线电波。但在化合物分子中，这个共振频率还与氢核所处的化学环境有关，处在不同化学环境中的氢核有不同的共振频率，称为化学位移。这是由核外电子云对磁场的屏蔽作用、诱导效应、共厄效应等原因引起的。同时由于分子间各原子的相互作用，还会产生自旋-耦合裂分。利用化学位移与裂分数目，就可以推测化合物尤其是有机物的分子结构。这就是核磁共振的波谱分析。ATRP聚酯大分子引发剂的300M核磁共振氢谱核磁共振波谱查询数据库系统数据库包含化合物核磁共振氢谱6万多张，核磁共振碳谱4万多张．可通过光谱编号、原子数、分子式进行查询，结果得到所要查询化合物的有关信息及其标准谱图．系统程序还允许用户将本研究领域一些常用化合物的标准谱信息和图谱添加进数据库以供日后查询．最早的核磁共振成像实验是由1973年劳特伯发表的，并立刻引起了广泛重视，短短10年间就进入了临床应用阶段。人体组织中由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的氢核，一般用氢核得到的信号比其他核大1000倍以上。正常组织与病变组织的电压信号不同，结合CT技术，即电子计算机断层扫描技术，可以得到人体组织的任意断面图像，尤其对软组织的病变诊断，更显示了它的优点，而且对病变部位非常敏感，图像也很清晰。质谱分析(massspectrometry,MS)是一种测量离子荷质比（电荷-质量比，charge-massratio）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯·阿斯顿于1919年制成的。出手不凡，阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素，研究了53个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的212种，第一次证明原子质量亏损。他为此荣获1922年诺贝尔化学奖。质谱仪种类非常多，工作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度，质谱仪可以分为下面几类：有机质谱仪：①气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）②液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）③其它有机质谱仪，主要有：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS），富立叶变换质谱仪（FT-MS）无机质谱仪：①火花源双聚焦质谱仪(SSMS）②感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）③二次离子质谱仪（SIMS）基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）AFT-ICRmassspectrometer傅立叶变换离子回旋共振质谱仪质谱仪的基本结构及工作流程单聚焦质谱仪示意图氰戊菊酯的结构及其质谱图近来,两种新质谱技术傅立叶变换回旋共振质谱(Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry,FTICR-MS)和毛细管电泳质谱(capillaryelectrophoresismassspectrometry,CE-MS)被用于代谢物图谱分析。FTICR-MS具有高通量的优点,可检测上千种代谢物,但不能区分异构体限制了它的应用;CE-MS检测灵敏度较高,可以检测低丰度代谢物,Soga等利用CE-MS在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中检测到一千多种代谢物。质谱谱图数据库收录了大部分常用化合物的质谱数据，检索途径为质荷比检索，丰度检索以及组合检索，可获取化合物质谱谱图，物化性质等信息。高效液相层析Highperformanceliquidchromatography70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达34个标准大气压。用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。HPLC图谱Liquidchromatography-massspectrometry气相色谱气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。gaschromatography1.乙醛2.甲醇3.乙醇4.正丙醇5.乙酸乙酯6.仲丁醇7.异丁醇8.乙缩醛9.正丁醇10.乙酸11.异戊醇12.丁酸乙酯13.丙酸14.乳酸乙酯15.丁酸16.己酸乙酯白酒分析：GCAgaschromatograph(right)directlycoupledtoamassspectrometer(left)乙氧氟草醚GC-MS质谱图采用何种分析技术主要取决于待分析生物系统的种类以及要解决何种科学问题。NMR可以快速、无损伤性地进行代谢物的体内(invivo)或体外(invitro)比较分析。直接应用MS进行代谢物分析虽然速度也较快,但具有灵敏度以及分辨率较低的缺点。将MS与GC或LC联用(GC-MS或LC-MS),虽然降低了分析速度,但却提高了分析灵敏度以及分辨率。而且基于质谱的分析技术已长期用于代谢物指纹图谱分析,具有比较成熟的样品制备、数据采集以及分析等操作程序。3代谢组学数据采集与分析与转录组、蛋白质组研究一样,代谢物可以通过与对照样品的比值进行相对定量。通过添加标准参照物以及对代谢物进行同位素标记,可以获得绝对定量的代谢组数据集。此外,数据采集的重复性以及采用何种数据处理方法对代谢组分析结果的影响很大。一旦获得代谢组的定量数据集,可以采用已在转录组、蛋白质组分析中得到应用的多种数据分析策略进行代谢组数据分析,这些分析策略的基本原则是比较实验组与对照组之间代谢物水平差异,并利用统计方法评估这些差异的显著性。代谢组数据的分析离不开化学统计学的应用。在利用NMR和MS进行的代谢组学研究中,化学统计学是指利用数学或统计工具进行光谱处理、峰比对、异常值检测以及数据均一化等。多变量分析是分析代谢组研究产出的复杂数据的一种有效方法,其中PCA(principalcomponentanalysis，主成分分析)是一种将原始特征压缩至最小可能性成分数的维数缩减方法,即用较少的综合性变量代替原来众多的相关性变量,使有关的研究简化。PCA已成为代谢组研究中最常规的分析方法。此外,偏最小二乘法(partialleastsquaresmethod，PLS)、独立成分分析(independentcomponentanalysis)、正则相关系数(canonicalcorrelation)、对比分析(correspondenceanalysis)、贝叶斯模型(Bayesianmodeling)以及隐含马尔可夫模型(hiddenMarkovmodels)等也是代谢组分析中常用到的模型分析方法。人类代谢组学标准物质数据库基于GC-MS的代谢组分析已被广泛的应用于发现药物或除草剂的作用模式和在生物技术中辅助揭开基因序列对代谢组和生命机能的影响。而建立代谢谱的前提和关键是从复杂的样本（例如血浆，细胞提取液，复杂植物动物样本）中快速，可靠，准确的识别大量的代谢物。GC-MS数据的定性分析传统上主要依靠相似度匹配，因此有人建立了