肿瘤学动物实验技能培训

肿瘤学动物实验技能培训2015年7月13日一、常用实验动物及选择——品系选择名称毛色免疫特性适合实验BALB/c白色野生型同基因型肿瘤实验C57BL黑色野生型同基因型肿瘤实验NudeBALB/c,裸鼠无毛胸腺缺陷，T细胞缺陷人移植瘤实验SCID白色T、B细胞减少，细胞免疫和体液免疫缺陷，巨噬细胞和NK细胞正常免疫功能重建，肿瘤学NOD/SCID白色与SCID相比，NK细胞减少免疫功能重建，肿瘤学NOG/NSG白色IL-2受体缺陷，与NOD/SCID相比，天然和获得性免疫缺陷更高免疫功能重建，肿瘤细胞治疗BALB/cC57BL裸鼠SCIDNOD/SCIDNOG/NSG成年动物的年龄、体重和寿命比较小鼠大鼠豚鼠兔狗成年日龄（天）65～9085～11090～120120～180250～360成年体重（g）20～28200～280350～6002000～35008000～15000平均寿命（年）1～22～3＞25～613～17最高寿命（年）＞3＞4＞6＞1334一、常用实验动物及选择——年龄选择一般购买6-8周小鼠，用于实验二、小鼠的饲养——环境微生物控制等级选择普通级动物：示教、预实验清洁级动物：适用大多数科研。无特定病原体动物（SPF）：为理想的健康动物，适用于所有科研、检定。无菌动物（GF）：适用于特殊研究。动物室环境控制要求值项目控制要求值备注温度21～27℃按动物品种而有若干差别湿度45～55%气流速度10～25cm/秒避免直吹风换气次数8～15次/小时100%新鲜空气（如使用循环空气，不应超过总空气量的1/3）照明75～300lux定时人工照明（分置小瓦数日光灯）氨浓度20ppm以下噪音50分贝以下无动物时（有动物时，除狗居外，不高于65分贝）二、小鼠的饲养——环境动物饲养密度动物饲养密度应符合卫生标准，有一定的活动面积，不能过分拥挤。各种动物所需笼具的面积和体积因饲养目的而异，哺乳期所需面积较大，一般小鼠4-6只/笼。二、小鼠的饲养——密度二、小鼠的饲养——垫料、饲料、水垫料、饲料均需经过辐照并密封包装。水，自来水121度高压灭菌20min。饲料选择营养均衡的配方饲料即可，特殊情况才选择高蛋白，高脂肪饲料。三、肿瘤建模肿瘤模型类型：皮下移植瘤、肺转移模型、原位移植瘤；查阅文献确定细胞接种浓度：一般1*106个细胞左右；预实验：以2倍比例选择三个细胞浓度开展预实验；准备细胞：细胞重悬于PBS、生理盐水或基础培养基中，定量；接种：皮下接种可选择乙醚麻醉，100ul/位点；肺转移尾静脉注射，用小鼠固定器，200ul/只；对于皮下移植瘤，如需细胞数量较大，可以接种组织块儿；皮下接种部位：Flank，背颈部，腋窝。四、标记与分组编号与标记方法•染色法•剪耳法•穿耳孔法•标牌法•烙印法•剪毛法•在每组动物不超过l0只或一个实验不超过40只的情况下适用•染色剂：3-5％苦味酸溶液，可染成黄色染色法：单色涂染法四、标记及分组——单色染色法•涂染原则：从左到右、从上到下•左前肢为1号、左侧腹部2号、左后肢3号，•两耳后部4号、背部5号、后肢背部6号，•右前肢7号、右侧腹部8号、右后肢9号•头部为40号、尾巴根为10号。方法步骤四、标记及分组——单色染色法•在每组动物不超过100只的情况下适用•常用染色剂：3-5％苦味酸溶液，可染成黄色，作为“个”位数•常用染色剂：0.5%中性红或品红溶液，可染成红色，作为“十”位数四、标记及分组——双色染色法•用两种颜色同时进行染色标记•用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，个位数的染色标记方法同单色涂染法•用品红(红色)染色标记作为十位数四、标记及分组——双色染色法方法步骤•左前肢为10号、左侧腹部20号、左后肢30号•两耳后部40号、背部50号、后肢背部60号•右前肢70号、右侧腹部80号、右后肢90号•第100号不作染色标记方法步骤•穿耳孔法：用专用耳空器在动物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定号码的方法。原则是：左耳代表十位，右耳代表个位。•标牌法：一般挂在动物的颈部、耳朵、脚上。•烙印法•剪毛法四、标记及分组——其他方法四、标记及分组——分组一致性原则差异是绝对的，一致是相对的利用随机数字表进行随机分组，最大限度避免人为因素五、治疗、给药治疗起点和途经根据不同的肿瘤和治疗药物不同而定；皮下移植瘤，尾静脉给药：50mm3,100mm3；皮下移植瘤，瘤内给药：200-300mm3；腹腔给药。六、肿瘤的测量皮下移植瘤：游标卡尺测量，称重，小动物活体成像；肺转移瘤：肺表面结节数，小动物活体成像；皮下移植瘤实验：生存期较长，有如下情况者处死小鼠，记为死亡：肿瘤长径达到2cm，或体积大于1cm3；蜷缩不动；毛发蓬松脏乱无光；对外界刺激无反应；体重明显下降的（24h内下降2-3g）。七、小鼠生存期统计——治疗终点转移瘤实验：一般生存期较短；八、动物组织标本采集收集心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，福尔马林固定，HE染色观察治疗毒性；治疗实验：收集肿瘤组织，福尔马林固定，观察肿瘤指标；免疫荧光实验：收集新鲜组织，做冰冻切片；九、动物实验伦理悉心照料动物，保证正常生存条件；皮下移植瘤体积最大长至长径2cm或体积1cm3；实验结束对小鼠进行安乐死，拖颈或CO2处死；十、动物实验安全抓取小鼠时小心被小鼠咬伤；注射给药时注意给药安全；实验过程中有毒化学试剂、标本的存放；