蛋白酶的生产和应用

蛋白酶的生产和应用上海工业微生物研究所胡学智蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。到本世纪初，已经报导的微生物蛋白酶估计超过900种，生物体的生理活动和疾病的发生如食物之消化吸收、血液之凝固、溶血作用、炎症、血压调节、细胞分化自溶，机体衰老、癌症转移、生理活性肽的活化等，莫不同蛋白酶有关．蛋白酶也同人类生活资料的生产息息相关，涉及人类生活的方方面面，全球酶制剂市场中蛋白酶的销售额达到60％。以下就个人多年来从事蛋白酶的生产和应用开发的一些学习体会做一汇报与大家交流。1．关于蛋白酶的分类与专一性(略)表l微生物蛋白酶的分类和底物专一性分类抑制最适优先切开的肽键(底物专一性)例子剂PH丝氨酸蛋白酶DFP9．5．10．5①胰蛋白酶型：切开点羧基侧胰蛋白酶，灰色链霉(EC3．4．21)PMSF是碱性氨基酸残基之肽键：菌，弗氏链霉菌，红霉PILys(Arg)一菌，链霉菌②碱性蛋白酶型：糜蛋白酶，枯草杆菌，切开点羧基侧是芳香族或疏水面包酵母，灰色链霉性氨基酸残基之肽键：菌，直丝链霉菌，米曲√rrp(Tyr，Phe，Leu)一霉③其它：粘细菌Y一裂解型和葡萄球菌型半胱氨酸蛋白PCM6El7-8①木瓜蛋白酶型：切开点羧基木瓜、无花果、菠萝、酶(EC．3．4．22)侧是任一氨基酸残基之肽键：组织蛋白酶-Phe(或Val，Leu)一Xaa_②梭状菌蛋白酶型：切开点羧溶组织梭状芽孢杆菌基侧是碱性氨基酸残基之肽键③链球菌型：广泛氨基酸之肽A群链球菌键金属蛋白酶EDTA7．9①中性蛋白酶型：切开点氨基枯草芽孢杆菌、热介蛋(EC3．2．23)OP端是疏水性氨基酸残基或任一白芽孢杆菌、腊状芽孢氨基酸之肽键-Leu(或Phe及杆菌、巨大芽孢杆菌、其它)灰色链霉菌、米曲霉、铜绿色假单孢菌，介淀粉芽孢杆菌、溶组织梭状芽孢杆菌②其它：粘杆菌蛋白酶天门冬氨酸蛋DAN2．5切开点两端是芳香族或疏水性米曲霉、黑曲霉、点青白酶氨基酸残基之肽键：．Phe(或霉、华根霉、微小毛霉、(EC3．2．24)Tyr，Leu)-Trp(或Phe，伽)米赫毛霉、栗疫霉、白色念珠菌、面包酵母、粘红酵母注：PFP．二异丙基磷酰氟PCMB：对氯汞苯甲酸PMSF．苯甲基磺酰氟DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯Ph马铃薯蛋白酶抑制剂OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)EDTA：乙二胺四乙酸2．关于微生物蛋白酶的生产蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％，我国2005年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48万吨，总销售额约20亿人民币，其中蛋白酶约10万吨，销售额近9亿人民币。细菌的中、碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产，而霉菌蛋白酶则更适于采用固体培养法生产，固体培养不易污染，管理容易，节省能源，单位容器产量高，日本和欧洲不少工厂广为采用。微生物生产蛋白酶与生长相有关，芽孢杆菌中性蛋白酶在对数生长期同步产生，而碱性蛋白酶则在对数生长期末芽孢形成时大量生成，芽孢形成起到产酶开闸的作用。不能形成芽孢的突变株一般不能大量合成碱性蛋白酶，丧失蛋白酶合成能力的突变株不能形成芽孢。曲霉固体培养时，蛋白酶活性在分生孢子老熟时达到最大值，液体培养时当菌体衰老自溶时，蛋白酶活性达到高峰。菌种突变或培养条件变化能使产酶期或酶系组成发生变动。蛋白酶的合成受分解代谢阻遏的调控，保持培养基中e／N较低水平或通过流加碳源，将还原糖浓度保持在阻遏浓度之下，例如碱性蛋白酶生产时保持培养液的糖浓度在O．4～1％可获高产。将培养液PH始终保持在6~7之间，不论对碱性、中性和酸性蛋白酶的生产都是有利的。蛋白酶是一诱导酶，其生物合成受底物及其类似物之诱导，也受到氨基酸或铵盐等易利用氮源之阻遏，但某些黑曲霉是个例外，培养基中需添加l~3％的NFhCl或其他铵盐才有高产．钙离子对蛋白酶的生物合成和稳定都很重要，液体培养基中添加O．5％的Ca2+。黑曲霉酸性蛋白酶可以增加50％，短小芽孢杆菌碱性蛋白酶生产可以增加35％，可是在固体培养下，C一+的作用并不突出。能生产蛋白酶的微生物很多，但所用菌种必须符合FAO／WHO食品添加剂专家委员会JECFA(JointFAO／WHOExpertCommitteeOnFoodAdditives)的评估标准，在美国酶制剂生产菌种须符合GRAS要求。微生物的产酶能力通过各种遗传育种手段已得到大幅度提高，雀巢公司的专利(VanDenBroeketal，USP6，090，607)(2000)报导，利用基因工程技术将米曲霉肽酶和蛋白酶活性提高了两倍以上．潘延云等报导，用原生质融合的方法，将碱性蛋白酶生产菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体PDW2的工程菌枯草杆菌BDl05进行细胞融合，得到一株高产蛋白酶工程菌A16，摇瓶发酵的酶活比2709高50．100％，最高达30000u／ml。基因工程改良菌种是当前最热衷的课题，工业用酶的80％已是用基因改良菌种生产的，但作为食品添加荆用的酶在欧盟、日本是遭拒绝的，许多工厂还都标示自己的酶是用非GMO生产的，食品工业用产酶菌种人们还是希望是采用诱变育种手段获得，目前国际市场上蛋白酶品种虽多，但其所用生产菌种都限于传统上食品加工用的微生物和确认无害的菌株。例如：碱性蛋白酶生产菌：液化淀粉芽孢杆菌(B．amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B．1icheniformis)、黄曲霉(A．flavus)、米曲霉(A．oryzae)、栖土曲霉(A．terricola)，冠状耳霉(Conidioluseoronutus)中性蛋白酶生产菌：枯草芽孢杆菌(B．sultilis)、热介蛋白芽孢杆菌(B．thermoprotyolyticus)、厌色链霉菌(st．griseus)、蜂蜜曲霉(A．melleus，弱碱性)。酸性蛋白酶生产菌：黑曲霉(A．nige0、斋滕曲霉(A．saitoi)、栗疫霉(Endothia)、米赫毛霉12(M．mehei)、丝立毛霉(M．pusillus)、根霉(Rhzopusssp)．表2是若干市售商品蛋白酶及其生产菌种。(根据各公司样本编制)商品名(制造厂)菌种用途碱性蛋白酶：Alacalas(Novozymes)地衣芽孢杆菌制革、洗涤剂、食品加工Protamax(Novozymes)地衣芽孢杆菌制革、洗涤剂、食品加工Savinase(Novozymes)地衣芽孢杆菌洗涤剂、食品加工Espcrase(Novozymes)嗜碱芽孢杆菌洗涤剂、纺织退浆Sabtilisin(Novozymes)地衣芽孢杆菌试剂ProleatherFG．F(天野)枯草芽孢杆菌食品加工、洗涤剂Protin—A(大和化成)枯草芽孢杆菌变制革、食品加工种AroaseAP．10(Yakult)枯草芽孢杆菌动植物蛋白质水解、制肽、可溶性鱼蛋白GodoBap(GodoShusei)地衣芽孢杆菌食品加工、洗涤剂Oricntase22BF(阪急共荣)枯草芽孢杆菌食品加工、洗涤剂Kazuosase(shawaDenko)芽孢杆菌洗涤剂中性蛋白酶：ProtinP(大和化成)枯草芽孢杆菌降低蛋白质黏度、蛋白质加工DiaskinC(大和化成)枯草芽孢杆菌乌贼鱼剥皮Orientase90N(阪急共荣)枯草芽孢杆菌蛋白质加工、制肽、调味料、蛋白质水解Neutrasc(Novozymes)枯草芽孢杆菌分解面筋蛋白、面包、饼干生产、蛋白质水解SpezymeFAN(杰能科)解淀粉芽孢杆菌水解蛋白质、酒精发酵ProteaseN“Amano”枯草芽孢杆菌水解乳清蛋白、制奶酪ProteaseNL“Amano”枯草芽孢杆菌水解乳清蛋白、制奶酪ProteaseS“Amano”脂肪嗜热芽孢杆高温水解蛋白质菌Thermoase(大和化成)芽孢杆菌耐热性蛋白酶、合成肽等Therrnolysin(大和化成)热解蛋白芽孢杆试剂、耐热性蛋白酶、合成肽等菌ProteaseA“Amano”2米曲霉含肽酶多、天然调味料ProteaseM“Amano”米曲霉婴儿乳品降低过敏性、调味料Umamizyme(天野)米曲霉风味酶、调味品ProteaseA米曲霉食品、饲料加工Flavourzyme(Novozyme)曲霉蛋白质水解、脱苦、调味液ProteaseIP(盛进制药)酱油曲霉食品饲料加工SumizymeLP(新日本)米曲霉动植物蛋白水解、面包、发酵食品SumizymeLPL(新日本)米曲霉面包制造。·SumizymeFP(新日本)米曲霉动植物蛋白水解、调味液SumizymeMP(新日本)蜂蜜曲霉弱碱性蛋白酶、调味液ProteaseP“Amano”6蜂蜜曲霉水解蛋白质Actinase(科研医药)灰色链霉菌试剂、食品加工、医药13PantiaseNP-2(Yokult)米曲霉调味料制造酸性蛋白酶：SumizymeAP(新日本)黑曲霉蛋白质水解、饲料SumizymeRP(新日本)根霉蛋白质水解、饲料Molsin(Seishin制药)斋藤曲霉消化剂、食品加工NeulaseF(天野)雪白根霉蛋白质水解ProteaseM“Amano”米曲霉(微酸性)制HVPProteasePD(盛进制药)杜邦青霉食品、饲料Stalase(Seishin制药)金黄曲霉消化剂ProteaseYP．SS(Yokult)黑曲霉蛋白质水解、制调味料Proctase(明治制果)黑曲霉饲料添加剂、消化剂Orientase20A(阪急共荣)黑曲霉蛋白质水解、调味料Protease(Matsutani)米曲霉谷物醋酿造Denapsin黑曲霉蛋白质水解SumizymeAP(新日本)黑曲霉SumizymeRP(新日本)雪白根霉MeitoRennet(MeitoSangyo)丝立毛霉奶酪制造3．蛋白酶的利用蛋白酶的用途非常广泛(表3)，最大的用户是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿酒酿造，以及制革工业和医药。表3蛋白酶的用途用途说明干酪制造凝固酪蛋白，缩短成熟时间酱油酿造预处理大豆，提高蛋白质利用率天然调味液制造水解蛋白质，增强风昧，制HVP、HAP酒精，酿酒水解蛋白质，促进酵母发酵啤酒澄清分解啤酒单宁蛋白沉淀，延长保质期酿醋缩短酿醋周期，增加食醋得率茶饮料分解茶汤蛋白质，改善过滤性，增强香味和稳定性烤焙食品分解面筋蛋白，软化面团，缩短揉面时间，增加延伸性肉类加工嫩化，肉骨处理，制骨汤’生理活性肽制造水解动植物蛋白质制生理活性肽生化制药制脏器水解物，水解蛋白等蛋白胨制造水解蛋白质制革、毛皮工业浸水、脱水、软化．明胶制造除去胶原纤维间隙蛋白质洗涤剂加酶洗衣粉烟草制造分解烟草蛋白质，改善烟味饲料添加剂制加酶饲料消化药直接作为消化剂消炎药清创，消炎，祛痰止咳感光胶片处理回收片基，银粒14蛋白酶应用于洗涤剂、制革工业、裘皮工业、明胶工业、丝绸脱胶、食品工业(干酪、蛋白质水解物脱苦和天然调味液制造、酱油生产、烤焙制品和肉类嫩化、合成二肽甜昧剂、茶饮料生产)、酒精、酿酒和酿造醋生产、功能性肽的制造、饲料制造、I临床治疗等。4．我国对蛋白酶的研制概况(1)中性蛋白酶我国对蛋白酶的研究始于1957年中科院微生物研究所和原轻工业部工业试验所曾收集和保存了一批酱油酿造用曲霉，肖永澜、方心芳等从117株黄绿色曲霉中筛选出12株蛋白酶活性高的曲霉，其中以栖土曲霉3,374的活性最强。1964年中科院微生物所、江苏省食品发酵研究所合作，就北微所筛选的枯草杆菌1938蛋白酶的生产条件进行详细研究。1965年完成中试后于新建的无锡酶制剂厂投产，1965年上海市工业微生物研究所对栖土曲霉3942蛋白酶的液体和固体培养工艺条件进行了研究，笔者发现固体培养时，添加3-5％纯碱，碱性中性蛋白酶活性可增加30％，液体培养时添加洗净剂LSO．1％，可使通风量下降50％以上，酶活性增加60％。枯草杆菌1938、栖土曲霉3942及放线菌166是国内生产中性蛋白酶的主要菌种，它们的发酵产酶水平在30多年来的不断改进，有了不少提高。1938的酶活由当初的2．3千个单位，