非放射性凝胶迁移试剂盒(EMSA)操作手册

非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册本说明书适用于产品号SIDET001-SIDET020的产品目录号产品名称包装SIDET001非放射性NF-κBEMSA50次结合反应SIDET002非放射性STAT1EMSA50次结合反应SIDET003非放射性STAT3EMSA50次结合反应SIDET004非放射性STAT5EMSA50次结合反应SIDET005非放射性AP-1EMSA50次结合反应SIDET006非放射性HIF-1EMSA50次结合反应SIDET007非放射性SP1/SP3EMSA50次结合反应SIDET008非放射性MEF3EMSA50次结合反应SIDET009非放射性CREBEMSA50次结合反应SIDET010非放射性TWISTEMSA50次结合反应SIDET011非放射性CDP/CUXEMSA50次结合反应SIDET012非放射性C/EBPEMSA50次结合反应SIDET013非放射性SREEMSA50次结合反应SIDET014非放射性Nrf2EMSA50次结合反应SIDET015非放射性EKLFEMSA50次结合反应SIDET016非放射性Ets1EMSA50次结合反应SIDET017非放射性HSEEMSA50次结合反应SIDET018非放射性NeuroDEMSA50次结合反应SIDET019非放射性GREMSA50次结合反应SIDET020非放射性Rbp-JEMSA50次结合反应1.简介EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比，Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。目前Viagene公司提供20多套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-kB（核转录因子-kB，Cat#;SIDET001）、STAT1（信号转导和转录激活因子1，Cat#;SIDET002）、STAT3（信号转导和转录激活因子3，Cat#;SIDET003）、STAT5（信号转导和转录激活因子5，Cat#;SIDET004）、AP-1（转录激活蛋白1，Cat#;SIDET005）、HIF-1（缺氧诱导因子1，Cat#;SIDET006）等，具体见该说明手册封面页或垂询Viagene公司。每种试剂盒均经过多次实验测试，并已优化了DNA-蛋白转录因子的结合条件。EMSA成套试剂配备足够的材料进行50次活化蛋白转录因子与特定DNA结合的测定；若每片凝胶做10个样品加上一个蛋白标准或指示，可以做五张膜。若每片凝胶做13个样品加上一个蛋白标准或指示，则可以做四张膜。实际应用中，因各个实验室使用的显示仪器与手段不同、感光胶片灵敏度以及胶片冲洗方法不一样，仅做一次曝光可能无法获得满意结果。当得到的图像太深或太浅时，则需要调整底物用量与曝光时间。由于用户很可能需要对同一张膜试用几次底物液，因而很难为EMSA试剂盒配备标准量的发光底物液。所以本试剂盒提供Viagene公司的Lighten®HRP-B底物发光系统（产品号；CHEM004）,可以做四片结合膜的EMSA实验，不够用时用户因此需要按所需用量另外购买与EMSA试剂盒配套的化学发光底物（产品号；CHEM001，CHEM002，CHEM003）。Viagene公司并提供与非放射性EMSA成套试剂盒配套的化学发光检测系统（产品号IMGR002）。Viagene公司的EMSA成套试剂盒主要用于科学研究，不推荐用于疾病诊断。2.试剂盒清单（1）EMSA试剂盒基本组分：z10×BindingBuffer（10×结合反应液）（4℃）1Vial（支）zPoly(dI:dC)（聚核苷酸竞争物）（-20℃）1Vial（支）z6×LoadingBuffer（6×上样缓冲液）（4℃）1Vial（支）zColdoligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）（-20℃）1Vial（支）zBiotin-LabeledProbe（生物素标记探针）（-20℃）1Vial（支）zStreptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）（4℃）1Vial（支）z2×BlockingBuffer（2×封闭液）（4℃）1Bottle（瓶）z5×WashingBuffer（5×洗涤液）（4℃）1Bottle（瓶）zEquilibrationSolution（平衡液）（4℃）1Bottle（瓶）zBinding-membrane（结合反应膜）（RT）4pieces（片）zUserManual（说明操作手册）1set（册）（2）EMSA化学发光底物系统：zLighten®HRP-BSubstrateSolutionA（底物液A）（4℃）*1Vial（支）zLighten®HRP-BSubstrateSolutionB（底物液B）（4℃）*1Vial（支）*本试剂盒提供的发光底物系统足够检测试剂盒配套的4片膜的EMSA操作。（3）EMSA-Plus试剂盒对照组分（需另购）：z阳性核抽提物对照（-80℃）*1Vial（支）z阴性核抽提物对照（-80℃）*1Vial（支）*如果使用者已经有或者可以自己制作阳性或阴性对照，则不必另购对照样品。对照样品因保质期有限，并且需要通过干冰运输供货，价格昂贵。3.自备实验材料与仪器z聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及相关化学试剂。z细胞培养装置与细胞核蛋白制备试剂。z电转移装置及相关化学试剂，较厚的用于蛋白转迹用滤纸。z紫外线交联仪。zViagene公司的CoolImager（产品号IMGR002），或感光胶片与感光胶片冲印装置。4.结合反应对每个核抽提物样品，按以下步骤于0.5ml离心管中操作。（1）结合反应体系：10×结合反应液1.5µlPoly(dI:dC)1.0µl细胞核提取物*?µl双蒸水?µl混匀室温静置20分钟生物素标记的探针0.5µl总量15µl混匀室温静置20分钟或以上（2）特异性反应确认竞争反应体系：10×结合反应液1.5µlPoly(dI:dC)1.0µl细胞核提取物*?µl未标记的竞争性寡核苷酸3.0µl双蒸水?µl混匀室温静置20分钟生物素标记的探针0.5µl总量15µl混匀室温静置20分钟或以上*每次结合反应需1-3µl核蛋白（根据核蛋白浓度而定），蛋白体积不应超过3µl（蛋白浓度不能过低），否则会影响结合反应过程。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）制备6.5%聚丙烯酰胺凝胶（以下用量可以制备2片70×80×1.5mm凝胶板）：在试管中混合以下组分：10×TBE1.0ml40%Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml50%Glycerol（50%甘油）1.0mldH2O（蒸馏水）14.8mlTEMED（四甲基乙二胺）20µl脱气10min10%AP（过硫酸胺）100µl总量20.0ml注:以上组分为制作两片70×80×1.5mm聚丙烯酰胺凝胶的用量，仅供参考。（2）制备预冷的0.25×TBE，4ºC保存:10×TBE30ml双蒸馏水1170ml总量1200ml（3）预电泳：用预冷的0.25×TBE在冰上120V预电泳1小时。并在上样前用电泳缓冲液冲洗加样孔3－5次/孔。（4）制备上样混合液：结合反应体系15.0µl6×上样液3.0µl总量18.0µl充分混匀后，14000rpm离心1分钟，加样（尽量在短时间内完成加样并电泳）。（5）电泳：将全部样品（18ul）加于样品孔中，低温下180V，电泳70分钟。6.电转印电转印可分为湿转和半干转两种，用户可根据实验要求和条件加以选择。（1）湿转1）配制电转印缓冲液：配制电转印缓冲液0.5×TBE1200ml。10×TBE60ml双蒸馏水1140ml总量1200ml电转印可在室温下进行。2）浸膜：将结合膜，2张厚滤纸和电转印泡沫垫在0.5×TBE浸泡10分钟（注意标记加样顺序）。3）装配电转印夹：电泳后，慢慢从凝胶上移走一片玻璃，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有TBE的盒中，在让凝胶与玻璃分离，使凝胶漂浮在TBE中。取一片预湿的滤纸在TBE中移动到凝胶板下面，小心将滤纸与凝胶对齐一起从TBE中移出，置于电转印泡沫垫上并按图示的顺序装配电转印夹。注意凝胶板与结合膜以及与滤纸之间不能有气泡。4）电转印：将装配好的电转印夹放入电转印槽中，在0.5×TBE中，390mA电转印40分钟。注意电转印的电极方向不能弄错。（2）半干转印以美国Bio-rad（伯乐）Trans-BlotSD半干转印仪为例1）配制电转印缓冲液：配制电转印缓冲液0.5×TBE200ml。10×TBE10ml双蒸馏水190ml总量200ml2）浸膜：将结合膜，与6张厚滤纸在0.5×TBE中浸泡10分钟（注意标记加样顺序）。3）装配电转印组件：电泳后，慢慢从凝胶上移走一片玻璃，将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5×TBE的盒中，让凝胶与玻璃分离，使凝胶漂浮在TBE中。取三张叠在一起的预湿的滤纸（注意滤纸之间不能有气泡）在TBE中置于凝胶板下面，小心将滤纸与凝胶对齐一起从TBE中移出，置于半干转印仪阴极板上（滤纸在下），依次在凝胶板上放置转印膜，三层叠在一起的预湿滤纸。然后将滤纸，转印膜，凝胶，滤纸组件整体移至半干转印仪阳极端。下图显示半干转印组件的放置顺序：4）电转印：盖好转印仪阴极端与上盖并接通电源。300mA恒流转印20min（5.5mA/cm2结合膜），转印中电压为10-15V。注意z使用不同品牌半干转印仪，请参考相关说明书。z采用厚转印滤纸。若使用普通滤纸需增加张数以达到厚滤纸的效果。z滤纸尽量裁剪为和凝胶同样大小。7.交联固定DNA电转移完后，移走滤纸。将结合膜取出。结合面朝上，于紫外交联仪中交联。若无交联仪，亦可置紫外灯下约10cm处交联10分钟。8.化学发光反应（1）准备检测试剂：从4℃取出2×封闭液与5×洗涤液，置于37℃温浴使白色沉淀溶解。（2）封闭结合膜：制备1×封闭液：2×封闭液7.5ml双蒸馏水7.5ml总量15ml将结合膜浸于15ml1×封闭液中，25℃孵育30分钟。（3）Streptavidin-HRP结合反应：制备Streptavidin-HRP（1:750）反应液：2×封闭液7.5ml双蒸馏水7.5mlStreptavidin-HRP20µl总量15ml弃封闭液，将结合膜与新配制的15mlStreptavidin-HRP反应液在25℃孵育20分钟。（4）膜洗涤：制备1×洗涤液：5×洗涤液12ml双蒸馏水48ml总量(15ml×4)60ml弃反应液，用1×洗涤液25℃洗膜4次，每次15ml，每次5分钟。（5）膜平衡：结合膜经4次洗涤后与15ml平衡液在25℃平衡5分钟。（6）底物液的化学发光反应：1）制备底物液：对每一张膜按以下用量临用前混合制备：Lighten®HRP-B底物液A*0.2mlLighten®HRP-B底物液B*0.2ml双蒸馏水1.2ml总量1.6ml2）将结合膜从平衡液中移出，放于不吸水的平面上，结合面为上面。将底物液均匀覆盖于膜的表面，依所用的图像显示方法按以下操作。注：Lighten®HRP-B底物化学发光系统覆盖于膜表面后请立即获取不同时间的图像，以免时间太长后化学发光信号减弱，影响成像。本底物在膜表面保持湿润环境下可持续发光约30分钟，一般15分钟后光信号开始减弱，请注意成像时间安排！9.化学发光图像显示（1）化学发光数字成像与检测：