桑叶中的有效成分研究及应用

柳州职业技术学院毕业设计（论文）题目：桑叶中的有效成分研究及应用姓名：李芊锋学号：20103005034专业：食品检测及管理年级：2010级指导教师：石少明完成时间：2012年11月桑叶中的有效成分研究及应用作者李芊锋摘要：为对进一步开发利用桑叶有效成分提供参考，介绍了桑叶中所含有的生物碱生物碱1-脱氧野尻霉素DNJ及黄酮类、多糖三种主要有效成分。介绍了桑叶中1-脱氧野尻霉素DNJ及黄酮类、多糖三种主要有效成分的提取工艺，如：如利用乙醇浸提法提取黄酮；利用超声波提取法提取多糖；利用微波法提取1-脱氧野尻霉素DNJ。介绍了桑叶有效成分的应用现状：在临床中的应用；在保健品种的应用；在视频中的应用，及其前景。关键词：桑叶有效成分提取工艺应用1-脱氧野尻霉素DNJ黄酮类多糖前言桑叶是桑属桑科类,为落叶乔木,高3～7m或更高,通常为灌木状,植物体含孔液。树皮黄褐色,棕灰白色或灰黄色,细长疏生,嫩时稍有柔毛。叶互生,卵形或椭圆形,长5～10cm,最长可达20cm,宽5～11cm,先端锐尖,基部心脏形或不对称,边缘有不整齐的粗锯齿或圆齿,叶柄长1.5～4cm,托叶披针形,早落。花单性,雌雄异株;花为黄绿色,和叶同时开放,雄花成穗状花序,萼片干裂,雄花有雄蕊,雌花无花柱,柱头2裂,向外卷。聚合果腋生,肉质有柄,椭圆形,长12.5cm,深紫色,或黑色,少有白色,花期4～5月,果期6～7月[1]。一、桑叶中的有效化学成分桑叶不仅可供食用，还具有降血压、降血糖抗菌、抗病毒和抑制癌症等药理作用［2］。这主要是由于桑叶中含有丰富的蛋白质、氨基酸、纤维素、多种人体必需的微量元素、桑叶多糖和生物碱类等多种功能性成分。1.1黄酮及黄酮苷类黄酮及黄酮苷类是桑叶化学成分中研究最多结构和成分比较明确的一类化合物包括堪非醇－3－氧－B－D－吡喃葡萄糖苷桔皮素－3－氧－6－氧－乙酰基－氧－B－D－吡喃葡萄糖苷等[3]。黄酮类化合物指以2-苯基色原酮为基核的一类化合物,以游离苷原或以与糖结合的苷类等形式存在于许多植物中[4],是一种生理活性物质,具有抗氧化、降血压、防止动脉硬化、抗衰老等作用[5]。黄酮类化合物作为桑叶的主要功能性成分之一,含有芸香苷、槲皮素、异槲皮素、二氢山萘素等成分,含量约占干叶重的1.0%~3.0%,是所有植物茎叶中含量较高的一种[6]。桑叶中的黄酮类化合物是天然的抗氧化剂,具有清除人体中超氧离子自由基的生理活性,药理实验已证明桑叶中的黄酮类成分具有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用[7],因此桑叶中黄酮类成分的提取分离纯化对开发利用桑叶具有重要的意义。目前,对桑叶的研究主要集中在它的药用价值和保健茶的开发上,对黄酮类化合物的研究虽然广泛,但作为油脂的抗氧化剂却少有报道。研究开发高效、安全、保健的天然抗氧化剂,使其在食品工业中得以广泛的应用具有重要意义。1.2多糖桑叶总多糖(TPM)具有很好的降血糖效果，TPM还可以提高糖尿病小鼠的耐糖量，增加肝糖元而降低葡萄糖，提高正常大鼠血浆中胰岛素含量。TPM的降血糖作用机理可能是通过促进胰岛素β细胞分泌胰岛素而发挥作用的。[8-9]桑叶多糖通过提高肝SOD活性、降低MDA水平而提高糖尿病小鼠抗氧化能力，促进胰岛β细胞修复，使胰岛素分泌增加，同时提高肝HK、肝PK活性等综合作用，促使血糖进入肝细胞，使肝糖元合成增加，葡萄糖氧化分解加快，从而达到调节糖代谢、降低血糖、改善糖尿病症状的作用。[10]1.3桑叶生物碱桑叶中含有丰富的生物碱，其中1-脱氧野高尻霉素（DNJ）是一种非常重要的生物碱，DNJ是一种哌啶生物碱，其化学名称是3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，是1-deoxynojirimycin的缩写[11]。DNJ的化学分子式为C6H13NO4,分子量为163。DNJ首先由M.Yagi等从桑根皮中分离得到并定名为“moranoline”。这是DNJ作为天然产物首先被分离。YoshiakiYoshikuni从桑中分离出了DNJ。通过改变DNJ的提取和纯化条件，从桑叶中分离出多种多羟基生物碱，包括DNJ、N-甲基-DNJ、2-氧-a-D-半乳吡喃糖苷-1-DNJ、fagomine、1，4-二脱氧-1，4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇、1，4-二脱氧-1，4-亚氨基-（2-氧-吡喃葡萄糖糖苷）-D-阿拉伯糖醇和1a，2，3a，4-四羟基-去甲莨烷等七种生物碱。桑叶中DNJ含量为0.11%。桑根中DNJ含量为0.14%[12]。桑叶中的生物碱可参与糖脂代谢,有利于降血压、血脂。桑叶中的蜕皮激素能促进细胞生产,促进人体蛋白质合成,排除体内胆固醇,降低血脂。桑叶中丰富的黄酮类化合物能改善心肌循环,具有抑制脂质氧化,抑制胆固醇的吸收,有降血压、防止动脉硬化等功能。此外,桑叶中所含γ-氨基丁酸是神经传递介质,并具有降血压和抗动脉硬化的作用。[13]图11-脱氧野高尻霉素二、桑叶有效成分的提取工艺1桑叶中黄酮及黄酮苷类的提取工艺1.1桑叶黄酮含量的测定[15]桑叶黄酮标准曲线的制作:准确称取0.010g槲皮素，蒸馏水溶解后，定容与100ml容量瓶中，然后用水稀释成以下浓度：10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml，40ug/ml，50ug/ml，60ug/ml，80ug/ml，100ug/ml。各取1.0ml，以蒸馏水为空白，分别加入1%三氯化铝蒸馏水溶液至10ml，摇匀—10min后，420nm、1.0cm比色杯，测定OD值,以OD值为纵坐标、每毫升所含微克数为横坐标作图既为标准曲线。图2槲皮素标准曲线经二元回归分析，得标准曲线方程：Y=0.003X－0.0053R2=0.9994式中：X——样品的浓度Y——吸光度1.2不同溶剂提取黄酮含量研究桑叶中黄酮主要是芦丁、槲皮素以及它们的衍生物等，其外还有大量的蛋白质和多糖等物质，它们与黄酮类物质在水、乙醇、甲醇等溶剂中的溶解度不同，因而，可通过选择合适的溶剂，使黄酮类物质溶于溶剂中，经固液分离，将黄酮类物质分离。本次实验选择水、乙醇、甲醇作为溶剂，结果如下：表1溶剂对浸提效果的影响图3溶剂对浸提效果的影响可见，用水作为溶剂，黄酮的浸出率较低，仅有12.59mg/g.。作为溶剂的乙醇，黄酮的浸出率要略微高于作为溶剂的甲醇对黄酮的浸出率。并且，由于乙醇常规性和经济性，有利于工业生产。因此，用乙醇作为溶剂提取黄酮是较好的方法。1.3不同温度对黄酮浸提的影响表2温度对浸提的影响图4.温度对浸提的影响表2.图3.表明，浸提温度对浸提效果的影响，随着温度的提高，黄酮的得率也提高，在60℃、70℃左右时，达到最高，在85左右时下降。所以，浸提温度不是越高越好，浸提温度可以70℃左右为宜。1.4PH值对浸提效果的影响表3PH值对浸提效果的影图5.PH值对浸提效果的影响从表3，图5表明：以PH6—9为宜，此时黄酮的浸提率较高，而值过高或过低都使黄酮的浸提率下降，PH值为4时，浸出率为21.56mg/g；PH值为10时，浸出率为24.36mg/g，据报道，PH值为8.36的碱性条件下，浸提效果最好。1.5毛细管电泳测定芦丁的标准曲线图6.芦丁的毛细管电泳标准曲线经计算机自动分析，得标准曲线方程Y=4.42123×10-6X－0.000233973R2=0.985012(P0.05)式中：X—面积Y—样品的含量1.6用毛细管电泳测定桑叶中槲皮素的标准曲线图7槲皮素的毛细管电泳标准曲线经计算机自动分析，得标准曲线方程Y=2.02589×10-6X+0.000489436R2=0.99784(P0.05)式中：X—面积Y—样品的含量表4.不同品种的桑叶中芦丁的含量(mg/g)表5.不同品种的桑叶中槲皮素的含量(mg/g)表6.不同时期的桑叶中芦丁槲皮素(mg/g)从表6可以看出，在同一产地不同采集期，6月份的桑叶中芦丁、槲皮素的含量较低，7月、8月、9月份的逐渐升高，10月份的桑叶的桑叶中芦丁、槲皮素的含量最高，而11月份的芦丁、槲皮素的的含量迅速下降。现代中药学认为，桑叶经霜后采集，药性为佳。近代名医张山雷认为：以老而经霜者为佳，是“欲其气之全，力之厚也。”另外，不同品种的桑叶中含量也不同，湖桑9001的芦丁的含量是湖桑32的2倍，白桑、鸡桑、广东桑的4倍。而槲皮素的含量，湖桑32最高，鸡桑最低。1.7桑叶有效成分的提取工艺总结在桑叶黄酮提取过程中，PH值、温度、溶剂浓度等对桑叶黄酮浸出率都有影响。用醇提黄酮要好于用水提黄酮。随着温度的升高，黄酮浸出率也提高，但温度过高反而下降。乙醇的浓度对浸提效果影响较大，在70%、80%的乙醇有利于黄酮得率，超过90%反而下降。正交实验表明：溶剂为乙醇时，浸提的优化工艺条件为80%的乙醇溶液，80℃，固液比1：30，浸提3个小时。溶剂为甲醇时，浸提的优化工艺条件为80%的甲醇溶液在固液比为1：20，60℃浸提2个小时，黄酮得率最高。用毛细管电泳测定桑叶中黄酮含量表明：在同一产地不同采集期，6月份的桑叶中芦丁、槲皮素的含量较低，7月、8月、9月份的逐渐升高，10月份的桑叶的桑叶中芦丁、槲皮素的含量最高，而11月份的芦丁、槲皮素的的含量迅速下降。现代中药学认为，桑叶经霜后采集，药性为佳。另外，不同品种的桑叶中含量也不同，湖桑9001的芦丁的含量是湖桑32的2倍，白桑、鸡桑、广东桑的4倍。而槲皮素的含量，湖桑32最高，鸡桑最低。2.桑叶多糖提取工艺优选超声波的机械化学作用通过破坏桑叶细胞壁和加强细胞内的传质作用，提高了植物中有机化合物的提取速度。超声波在液体内传播时，液体介质不断受到压缩和拉伸，在拉力作用下，液体断裂形成暂时的近似真空的空洞；压缩时，这些空洞就会发生崩溃，出现局部高温以及放电现象，产生空化作用。超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化，空化泡瞬间长大破裂，吸收的能量在极短的时间和极／b的空间内释放出来，形成高温高压的环境，同时伴随有一定强度的冲击波和微声流，从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间破裂，释放细胞内的有效成分，大大提高了提取效率，尤其是适用于桑叶和颉草属植物的提取。使用超声波法提取桑叶中多糖所需时间较短，提高了速度和效率。[15-16]3.桑叶生物碱1-脱氧野尻霉素DNJ提取的工艺3.1材料与方法3.1.1材料与试剂材料：桑叶、DNJ标准品3.1.2仪器仪器：FW80型高速万能试样粉碎机,HH-S数显恒温水浴锅,DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱,SHB-3循环水多用真空泵,201D-Ⅱ旋转蒸发器,WD700TL17-3格兰仕机械型烧烤微波炉,752型紫外可见分光光度计,BS200S电子天平。3.1.3.方法1)样品提取分别称取1g桑叶粉(过100目筛)9份,按L9(34)正交实验设计的3个因素(微波功率、时间、固2)液比)3水平破壁提取,趁热过滤,洗涤残渣,浓缩,置于50mL容量瓶中,作为供试品溶液待用。3)标准溶液的配置精确称取2.5mgDNJ标准品,将其在烧杯中溶于少量水中,移入25mL容量瓶,冲洗烧杯和玻璃棒3次一并移入容量瓶,加蒸馏水定容至25mL,即得0.1mg/mL的DNJ标准溶液。4)特异吸收波长的确定按碘-碘化钾试剂与DNJ标准溶液体积比为1∶30的比例加入试管,均匀混合后,以碘-碘化钾试剂(称取1gI2及10gKI,溶于50mL水中,加热,加2mL醋酸,再用水稀释至100mL即可)与水体积比为1∶30的溶液作为空白对照,在紫外-可见分光光度计上以波长范围为300～450nm的单色光为入射光,扫描测定该溶液的吸收光谱,确定特异吸收波长为334nm。5)DNJ标准曲线的制作分别吸取不同体积(5μL、10μL、20μL、40μL、80μL)的DNJ标准样品溶液,放入5支试管中,加少量碘-碘化钾试剂作显色剂,加蒸馏水至样品溶液总体积为2mL,混匀,在所得波长下按照1.3.3测量各个试管中溶液的吸收值。做三次平行实验,取其平均值。以DNJ标准溶液的浓度为横坐标,以相应的平均值为纵坐标,绘制标准吸收曲线,得标准曲线为:A=0.0497C+0.1086,R2=0.976。6)样品测定供试品溶液置于334nm