流式细胞术检测凋亡的方法

多色流式分析试剂典范流式检测细胞凋亡几种方法的比较2005年10月合肥动员★Caspase激活脱水致细胞皱缩核染色质凝缩★线粒体膜电位丧失★细胞膜PS外翻★核碎片形成★DNA被切割成低分子量片段细胞内酸化凋亡小体形成凋亡启动凋亡早期凋亡中期凋亡晚期多色流式分析试剂典范细胞膜事件—AnnexinVƒ正常细胞(NormalCell):膜内----磷脂酰丝氨酸(PS)膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂ƒ凋亡细胞(ApoptoticCell):膜内----磷脂酰丝氨酸(PS)膜外----磷脂酰胆碱、鞘磷脂、PS细胞膜事件—AnnexinV坏死细胞早期凋亡细胞活细胞ƒ检测方法：收集细胞并重悬于BindingBuffer(结合液)中加荧光标记的AnnexinV和PI流式细胞仪检测结果室温、避光孵育5分钟独立的核膜破损严重的细胞晚期凋亡细胞细胞膜事件—AnnexinVƒ检测特点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。¾细胞制备(如贴壁细胞)或储存时细胞膜的破损会导致PS跨膜分布的改变，造成假阳性；¾巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，AnnexinV检测也会阳性。™注意事项：多色流式分析试剂典范线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ发生在凋亡的早期ƒ可能与细胞色素c和AIF的释放相关，在存在活化Caspase的细胞中持续一段时间后恢复正常线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ染料—JC-1(5,5’6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide)亲脂性阳离子荧光染料正常细胞—线粒体内多聚体---红色荧光(Ex:488nm,Em:580/590nm)凋亡细胞—细胞质内单体---绿色荧光(Ex:488nm,Em:510/527nm)喜树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，3小时后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见，凋亡细胞红色荧光降低。线粒体膜电位(△Ψm)的崩溃ƒ检测方法：收集细胞于MitoCapture溶液(含JC-1)中离心、去上清重悬于孵育缓冲液中37oC孵育15-20分钟流式分析FL1:凋亡细胞；FL2:正常细胞ƒ检测特点：¾简便；¾快速产品名称产品编号规格生产商K250-2525testsBiovisionK250-100100testsBiovisionMitoCaptureTMApoptosisDetectionKit™注意事项：¾最近研究发现，线粒体膜电位的崩溃在有些细胞中并不是细胞色素c和AIF释放的必需条件。多色流式分析试剂典范抑制性底物ƒ荧光标记的Caspase抑制性底物膜通透性高；不可逆结合荧光标记的Caspase抑制性底物被凋亡细胞摄取并结合，而正常细胞不能结合该底物。因此洗涤后，凋亡细胞可检测到荧光，正常细胞则不能。ƒ检测原理：FITC(Rhodamine)-VAD-FMK(通用)FITC(Rhodamine)-VDVAD-FMK(Caspase-2)FITC(Rhodamine)-DEVD-FMK(Caspase-3)FITC(Rhodamine)-IETD-FMK(Caspase-8)FITC(Rhodamine)-LEHD-FMK(Caspase-9)活化Caspase的检测细胞凋亡时活化Caspase-3的检测。Jurkat细胞无诱导(A)或用喜树碱诱导6h后，使用CaspGLOWTMFITCCaspase-3StainingKit(产品编号：K183-100)检测活化的Caspase-3。的检测ƒ检测方法：诱导细胞凋亡加入荧光标记的抑制性底物(如FITC-VAD-FMK等)离心、洗涤2次37oC孵育0.5-1小时重悬细胞、流式分析FITC:FL1；Rhodamine:FL2ƒ检测特点：¾简单；¾灵敏¾快速(0.5-1小时)™注意事项：荧光标记的Caspase抑制性底物的特异性不够高，在凋亡细胞中可能也会与Caspase以外的蛋白结合。适用于区分凋亡和坏死的细胞。1.荧光标记的Caspase抑制性底物活化Caspase的检测产品名称规格生产商CaspGLOWTMGreen(Red)Multi-CaspaseStaningKit25tests/100testsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)Caspase-2StaningKit25tests/100testsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)Caspase-3StaningKit25tests/100testsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)Caspase-8StaningKit25tests/100testsBiovisionCaspGLOWTMGreen(Red)Caspase-9StaningKit25tests/100testsBiovisionƒD2R[(aspartyl)2-rhodamine110，二门冬氨酰-罗丹明110]–Caspase通用底物¾膜通透性高¾D2R为非荧光物质¾D2R被活化的Caspase剪切后，释放出Rhodamine110，发出绿色荧光2.Caspase底物活化Caspase的检测CaspSCREEN凋亡检测试剂盒对凋亡的分析。喜树碱(Campothecin)(2uM)诱导Jurkat细胞4小时，收集细胞并用CaspSCREENCaspaseScreeningKit(产品编号：K200-100)染色，流式分析。的检测ƒ检测方法：收集细胞并重悬于D2RIncubationBuffer(孵育液)中加DTT和D2R流式细胞仪分析(FL1通道)Ex/Em=488/530nm37oC孵育10-20分钟¾简单¾高度敏感¾快速(20分钟)¾特异性高ƒ检测特点：产品名称产品编号规格生产商K200-2525testsBiovisionK200-100100testsBiovisionCaspSCREENTMCaspaseScreeningKit多色流式分析试剂典范亚二倍体峰(凋亡峰)凋亡细胞比例;细胞周期分布;凋亡发生的时相ƒ染料：PI(碘化丙啶)亚二倍体峰(凋亡峰)™注意事项：¾固定：乙醇，不能用多聚甲醛。联科公司即将引进小片段DNA高效抽提试剂盒。对照(未诱导凋亡)凋亡(常规方法抽提)凋亡(高效抽提)亚二倍体峰(凋亡峰)™注意事项：¾试剂的选择---不能用抽提细胞核的试剂：BD公司的CycletestPlusDNAReagentKit(用去污剂Sperminetetrahydrochloride破膜)BeckmanCoulter公司的DNA-PrepReagentSystem(用DNA-PrepLPR破膜)凋亡细胞的核碎片被误认为多个凋亡细胞；进行有丝分裂的标本破膜后释放出的多个染色体或其聚集体被误认为多个凋亡细胞；细胞辐射等造成的微核体也可被误认为多个凋亡细胞。¾若凋亡发生在G2,M或S期晚期，DNA含量可能会等同于G0期或S期早期，导致检测失败；¾现有DNA分析软件(Modfit/MultiCycle)的缺陷。法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)ƒ检测原理：TdT+dUTP/BrdUTP荧光标记的dUTP/BrdUTP抗体™注意事项：BrdUTP的掺入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高；而且经济。法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)用树碱(CPT)诱导HL-60细胞凋亡，0、120和150分钟时用TUNEL(BrdUTP)/PI双染法检测DNA断裂，同时分析细胞周期。可见凋亡随着诱导时间的增加而增多，且可知凋亡发生的时相。凋亡细胞凋亡细胞法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)ƒ检测方法：TdT/FITC-dUTP标记细胞固定细胞/组织TdT/BrdU标记细胞洗细胞Anti-BrdU-FITC染细胞PI/Rnase处理流式分析Apo-BrdUKit洗细胞PI/Rnase处理Apo-DIRECTKit洗细胞洗细胞流式分析洗细胞固定：多聚甲醛(交联型)TUNEL/PI双染：¾区分凋亡和非凋亡细胞¾同时分析细胞周期法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法)产品名称产品编号规格生产商ApoBrdUDNAFragmentationAssayKitK401-6060testsBiovisionApoDirectDNAFragmentationAssayKitK401-6060testsBiovision¾成纤维细胞、上皮细胞凋亡时并不发生核小体间DNA的断裂(DNA仅断裂为50-300kb的大片段即终止)，TUNEL法的灵敏度无法检测出™注意事项：多色流式分析试剂典范阳性和阴性质控：产生误差的原因：¾非典型性凋亡¾操作不当TUNEL实验时TdT酶因保存不当而失活；染色时出现错误。解决方法：¾设立阳性质控¾设立阴性质控自己制备质控细胞或由公司提供(如TUNEL法试剂盒内包含了阳性和阴性质控细胞)凋亡假阳性：产生原因：¾PS的外翻使得凋亡细胞和凋亡小体很容易被邻近的细胞所吸附并被吞噬¾吞噬细胞并非仅为专职的吞噬细胞(如单核和粒细胞)，成纤维细胞或上皮细胞也具吞噬作用。尤其是实体瘤，常可见在凋亡细胞周围的肿瘤和非肿瘤细胞中有含有凋亡小体的吞噬体。例证：¾化疗后患者骨髓中的非凋亡细胞，主要是单核和巨噬细胞中可发现大量的凋亡小体，且TUNEL法检测时强阳性。BednerE.,LiX.,etal.1999.Cytometry29:191-196¾邻近细胞吞噬凋亡细胞后的残留物中即包含了变化的细胞膜、断裂DNA等凋亡特征物。¾即使很轻微的处理，如胰酶消化、机械振荡、细胞刮取等，均会造成PS的外翻。检测时面临的问题区分凋亡、坏死和凋亡的“坏死期”：产生原因：¾晚期凋亡与坏死相似细胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV结合实验无法区分。解决方法：¾形态学特征是区分凋亡和坏死的“金标准”。¾胰酶消化时间过长、机械损伤(如细胞刮取、肿瘤细胞分离或反复离心等)、电穿孔或某些药物处理时，细胞膜的通透性和对称性均会改变。检测时