浙江省生物选修一《生物技术实践》知识点归纳

选修1《生物技术实践》知识点归纳实验1大肠杆菌的培养和分离1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少，。划线最后，可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10～20小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释到10-5～10-7之间，然后去0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。3.在培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的，各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌（防止杂菌污染）。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。4.细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样（五类）。人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类；植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类；微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。4.无菌技术（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。（2）消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。5.培养基（1）培养基可分为液体培养基和固体培养基（按照物理性质）。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。（2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境）、特殊营养物质等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。（3）培养基配制的原则：目的要明确、PH值要适宜、营养要协调和要经济节约。实验4果汁中的果胶和果胶酶1.果胶是植物细胞壁的以及胞间层的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。下面是果胶的结构式：山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果胶的作用。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。2.果胶是植物细胞壁和胞间层的主要组成成分之一。在果汁加工中，果胶的存在易导致果汁出汁率低，果汁浑浊。果胶酶分解果胶的作用是：①瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易；②把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清，因此可以解决果汁加工中出现的问题。果胶酶是一类酶的总称，包括：多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。在植物细胞工程中果胶酶的作用是与纤维素酶一起除去植物细胞的细胞壁。实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果1.洗衣粉主要成分：表面活性剂，水软化剂，碱剂，漂白剂等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂，香精和色素，以及填充剂等。2.加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉,目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶。其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。3.（碱性）蛋白酶的作用是使蛋白质水解成可溶于水的小分子肽和氨基酸。蛋白质多肽氨基酸脂肪酶的作用是将大分子的脂肪水解为小分子的物质，甘油和脂肪酸。脂肪甘油+脂肪酸4.影响酶活性的因素有温度、酸碱度和表面活性剂。此外，加酶洗衣粉也不宜长期存放，存放时间过长会导致酶活力损失。5.实验操作课题名称：温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响。实验目的：比较不同温度下加酶洗衣粉的洗涤效果。实验原理：酶的催化活性受温度影响，在适宜温度下酶的催化活性最高，温度过低或过高酶的催化能力降低。实验材料：加酶洗衣粉、天平、白色棉布、1000mL烧杯、玻棒、温度计、滴管、新鲜鸡血、水浴缸、温度分别为5℃、15℃、25℃、35℃的清水。实验步骤：（1）取10cm×10cm的白色棉布4块，用滴管各滴加5滴新鲜鸡血，晾干备用。（2）取1000mL烧杯4个，用天平分别称取0.5g加酶洗衣粉，依次倒入4个烧杯中。（3）将5℃、15℃、25℃、35℃清水各500mL依次倒入4个烧杯中，用玻棒搅拌溶化洗衣粉。（4）取水浴缸4个，依次倒入5000mL5℃、15℃、25℃、35℃清水，插入温度计保持恒温。（5）将4个烧杯分别放到相同水温的水浴缸中，将带鸡血的棉布分别放到烧杯中浸泡20min。（6）按相同方式用不同玻棒搅拌棉布各，放到水浴缸中。结果分析与评价：不同种类的洗衣粉对同一污渍或不同污渍洗涤效果的列表比较污染物蛋白酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉油渍血渍奶渍果汁渍6.常见问题解答①为什么洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的水内数小时？如何缩短衣物的浸泡时间？是为了使洗衣粉中的蛋白酶充分的分解衣物中的蛋白质污渍；用温水浸泡衣物，因为酶的催化作用需要适宜的温度。②为什么不能在60℃以上的水中使用此洗衣粉？使用加酶洗衣粉时，必须注意洗涤用水的温度，温度过高会使酶变性失活。在低温下酶的活性下降。③试解释为什么此洗衣粉不能用于丝质及羊毛衣料？因为蛋白酶能使蛋白质水解，而丝质及羊毛衣料中含有蛋白质，这样会损坏衣物。④为什么使用加酶洗衣粉洗衣后，须彻底清洗双手？酶酶酶人体皮肤细胞有蛋白质，如不彻底清洗双手，就会使手的皮肤受到腐蚀。而使人患过敏性皮炎、湿疹等，因此，应避免与这类洗衣粉长时间地接触。⑤脂肪酶对沾有矿物油的棉布是否起作用?不起作用。脂肪酶只对羟基和羧基形成的酯键起作用，而矿物油多为饱和链烃，没有酯键。实验7α-淀粉酶的固定化及淀粉水解1.酶的生产①提取法：采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来。优点：简单易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值。缺点：要有充足的原材料，广泛应用受到限制。②发酵法（常用方法）：通过微生物发酵获得所需要的酶。优点：易培养、繁殖速度快、便于大规模生产。2.酶制剂的优点：催化效率高、低能耗、低污染等。酶制剂的缺点：通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后会混在产物中(难分离），可能影响产品质量。3.固定化酶：固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。固定化酶的优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；固定在载体上的没可以被反复利用。4.固定化酶方法：吸附法、交联法、包埋法、共价偶连法等。5.实验操作实验原理：本实验是用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。设备及用品：5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气门心及夹子、注射器架、试管及微量离心管3支。材料：①α-淀粉酶的固定化:在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中.由于酶不纯,可能有些不溶物。再加入5g石英砂,不时搅拌,30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)。用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为1ml/min。②可溶性淀粉溶液:取50ml可溶性淀粉溶于100ml热水中,搅拌均匀。③5mmol/LKI-I2溶液：称取0.127g碘和0.83g碘化钾。加蒸馏水100ml完全溶解后装入滴瓶中。步骤：①将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱。在流出5ml后接收0.5ml流出液,加入1～2滴KI-I2溶液,观察颜色.用水稀释1倍后再观察颜色。②实验后,用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4℃冰箱中,几天后再重复上述实验,看是否有相同的结果。实验反思：如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶?可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。实验8果酒及果醋的制作（一）实验原理1．酵母菌的细胞呼吸酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，反应式：C6H12O6+O2CO2+H2O+能量酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C6H12O6C2H5OH+CO2+能量2．酵母菌发酵的最佳环境酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活：在有氧时，酵母菌大量繁殖，但是不起到发酵效果；在无氧时，繁殖速度减慢，但是此时可以进行发酵。在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。3．醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。表达式为：C2H5OHCH3COOH+H2O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃(二)实验步骤挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）1.对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2.取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的子粒。3.用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反复多次冲洗。4.用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后，用洁净的纱布过滤至发酵瓶中，盖好瓶盖。如果没有合适的发酵