上海交大第9章生化 (刘建华)

BiochemistrySixthEditionChapter9:CatalyticStrategiesCopyright©2007byW.H.FreemanandCompanyBerg•Tymoczko•Stryer国际象棋和酶都使用策略，国际象棋通过比赛发展策略，而酶则通过进化建立酶促反应机制。右边是能够酶切肽键的活性位点，由三个氨基酸残基（化学键是白色）构成。用黑色化学键表示的底物分子如同左边比赛中已经落入圈套的国王，面临被裂解的命运。酶催化效率高、特异性强、条件温和。这些特征的基础是什么？介绍四类酶促反应的机制，丝氨酸蛋白酶、碳酸脱水酶、限制性核酸内切酶、和核苷单磷酸激酶。前三类将水分子加成到底物分子上，第四类避免水分子的加成。经过大量的实验研究（包括蛋白质结构测定、定点突变），这些酶的催化机制已经清楚。基本策略是结合能、诱导匹配、和一些特殊的催化策略，协助底物形成转化态。每类酶的催化机制能解决各种化学反应所面临的问题。•蛋白酶：将缺乏催化剂和pH7.0几乎不发生的反应(蛋白质水解）进行下去。•碳酸脱水酶：将化学反应加速到能够与其他快速生理过程融合的水平。•限制性内切酶：实现酶切反应的高度特异性。•NMP激酶，磷酸基团从ATP转移给另一个核苷酸（而不会转移到水分子）。酶采用的几个基本的催化原则底物与酶结合启动催化。结合能是酶和底物之间形成大量弱相互作用所释放的自由能。这种结合能既可建立底物特异性，又能增加酶促效率。当底物转化成转化态，底物与酶之间完全互补。因此酶和底物之间的相互作用稳定转化态，从而降低反应的活化自由能。结合能对酶分子和底物的结构变化都有促进作用，使它们相互间匹配度更高（诱导匹配），有助于催化反应。酶通常采用下列一种或几种策略催化特定化学反应。1.共价催化。共价催化的活性位点有活泼基团，通常是很强的亲核基团。在酶促过程中亲核基团能暂时性共价连接底物。胰凝乳蛋白酶就采用这种策略。2.酸碱催化。酸碱催化中，水分子之外的物质提供质子或接受质子。3.接近催化。很多酶有两个不同的底物。将两种底物置于一个酶分子的同一结合面能显著增加反应速度。4.金属离子催化。金属离子起催化作用的方式有几种。有的是配位作用产生OH-离子（亲核试剂），有的本身是亲电试剂，稳定带负电荷的中间体，还有的作为底物与酶结合的桥梁，增加结合能、将底物置于酶分子合适位置适于催化。蛋白酶能促进非常难于发生的反应图9.1胰凝乳蛋白酶的特异性。裂解芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已经用桔色涂出）C-端肽键（用红色标出）。图9.2胰凝乳蛋白酶有一个很活泼的丝氨酸。用DIPF处理，胰凝乳蛋白酶分子28个丝氨酸残基中195位丝氨酸与DIPF反应，导致胰凝乳蛋白酶失活。胰凝乳蛋白酶具有高度活泼的丝氨酸图9.3颜色底物。胰凝乳蛋白酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯产生黄色产物对硝基苯酚。在pH7.0，对硝基苯酚解离。停留法(stopped-flowmethod)检测反应的起始状态，能够在毫秒范围内混合酶和底物、跟踪毫秒时间内的反应结果。结果显示起始状态迅速形成一种颜色产物，随后缓慢（即进入稳态）（图9.4）。这些结果提示，酶促反应过程有两个步骤，第一步很快，第二步很慢。图9.4胰凝乳蛋白酶催化的动力学。酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯酚酯有两个阶段：快速（稳态前）阶段和稳态阶段。胰凝乳蛋白酶促水解反应的两个步骤涉及酶与底物的共价结合（图9.5）。第一步，底物的酰基与酶共价结合，同时释放对硝基苯酚或胺类（如果底物是酰胺键）。酶-酰基复合物称为酰化酶中间物。第二步，酰化酶中间物水解，释放底物的羧酸组分和游离酶。酶酰化并释放对硝基苯酚的速度很快，但是水解酰化酶“恢复”游离酶的速度很慢。图9.5共价催化。胰凝乳蛋白酶水解有两个阶段：（A）酰化形成酰化-酶中间体；随后(B)去酰化释放游离酶。1967年DavidBlow解析了胰凝乳蛋白酶的三维结构。球状、三条多肽链、二硫键连接在一起。合成的时候是一条多肽链（胰凝乳蛋白酶原）。蛋白酶裂解蛋白酶原（酶原活化），生成三条多肽链。酶促活性位点有Ser195，位于酶表面的裂缝中（图9.6）。活性位点的结构说明Ser195特别活泼（图9.7）。Ser195的侧链与His57的咪唑环形成氢键。咪唑环的NH又与Asp102形成氢键。活性位点氨基酸残基这样的排布称为催化三体。这种排布使Ser195特别活泼。组氨酸残基定位Ser残基侧链，极化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His57侧链接受Ser195侧链羟基的质子，因此His57是碱催化剂。Ser195丢失氢离子，产生烷基氧离子。烷基氧离子的亲核性比羟基大得多。Asp102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His57更能接受Ser195的质子。球状、三条多肽链、二硫键连接在一起。酶促活性位点有Ser195，位于酶表面的裂缝中（图9.6）。活性位点的结构说明Ser195特别活泼（图9.7）。Ser195的侧链与His57的咪唑环形成氢键。咪唑环的NH又与Asp102形成氢键。活性位点氨基酸残基这样的排布称为催化三体。这种排布使Ser195特别活泼。组氨酸残基定位Ser残基侧链，极化Ser侧链的羟基（去质子）。底物存在时，His57侧链接受Ser195侧链羟基的质子，因此His57是碱催化剂。Ser195丢失氢离子，产生烷基氧离子。烷基氧离子的亲核性比羟基大得多。Asp102协助His57定位，通过氢键和静电相互作用使His57更能接受Ser195的质子。第一步：底物与酶结合。第2步：His57（碱催化）接受Ser195质子，后者的氧亲核攻击目标肽键的羰基碳原子，使这个碳从平面结构转化成四面体结构。羰基碳原子的四面体结构不稳定（因为羰基原来的氧原子带有负电荷），但是氧负离子与酶蛋白的氧负离子洞的NH基团（图9.9）相互作用稳定，从而稳定羰基碳原子四面体（转化态）。第3步，四面体崩溃产生酰化酶。His57的正电荷侧链给要断裂肽键的氨基提供质子（酸催化）。第4步，断裂肽键的氨基成分离开酶，完成水解反应的第一阶段反应（酶的酰化）。第二阶段是酶的脱酰反应。酰化酶酯键的水解反应基本上是重复第2至第4步。第5步：水分子占据先前底物氨基成分所在的位置。第6步：，His57（作为碱催化剂）的咪唑环吸收水分子的质子，产生的OH-离子攻击酰基的碳原子，形成四面体碳原子。第7步：His57作为酸催化剂，提供质子导致四面体碳原子崩溃，断裂形成羧基。第8步：释放羧酸产物和游离酶。图9.8胰凝乳蛋白酶水解肽键的催化反应。肽水解可以解释共价催化和酸碱催化机制。反应过程包括8步：（1）底物结合；（2）丝氨酸亲核攻击肽键的羰基碳原子；（3）四面体崩溃；（4）氨基组分释放；（5）水分子结合；（6）水分子亲核攻击酰化酶中间体；（7）四面体崩溃；和（8）羧酸成分释放。虚线表示氢键。图9.9氧负离子洞。胰凝乳蛋白酶促反应的氧负离子中间体用氧负离子洞稳定。氧负离子洞的肽键NH与氧负离子中间体形成氢键（绿色虚线）。该机制能解释胰凝乳蛋白酶促反应的所有特征，但不能解释这个酶的底物特异性。酶与底物类似物和抑制剂形成复合物的三维结构，发现酶分子有一个相对疏水的深口袋，称为S1口袋，适于长的非极性氨基酸侧链。适当侧链与该口袋结合将邻位肽键定位于断裂位点（图9.10）。胰凝乳蛋白酶的底物特异性几乎完全取决于肽键N-端的氨基酸侧链。图9.10胰凝乳蛋白酶特异性口袋。胰凝乳蛋白酶底物结合口袋用相对疏水的残基构建、很深，有助于结合长的疏水性残基如苯丙氨酸（绿色）侧链。活性位点195位Ser定位在断裂肽键。构成结合位点的关键残基已经标出。其他蛋白酶的底物特异性更为复杂。这些酶分子表面还有其他口袋识别底物分子的其他残基。断裂肽键的N-端残基分别称为P1，P2，P3（从C-断向N-端编号），断裂肽键C-端氨基酸残基分别是P1',P2',P3'（从N-端向C-端编号）。相应地，结合这些位点的口袋对应地称为S1,S2或S1',S2'等。图9.11蛋白酶和底物先互作用的命名方法。底物与酶潜在的相互作用位点用红色的P表示。酶分子相应的结合位点用S表示。断裂肽键（用红色标出）是这种命名的参考位点。图9.12胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结构类似性。将胰凝乳蛋白酶（红色）置于胰蛋白酶（蓝色）之上，显示两者相似度很高。此处仅显示a-碳原子骨架。两种蛋白质分子之间a-碳原子误差是1.7A。图9.9胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和弹性蛋白酶的S1口袋。有些氨基酸残基在决定这些酶的特异性方面起关键作用。用颜色标出了这些残基的侧链和活性位点的丝氨酸。枯草杆菌蛋白酶（不是胰凝乳蛋白酶同源物）也有催化三联体活性位点和氧离子洞，但是这个酶的氧离子洞的一个氨基来自天冬酰胺残基的侧链而不是肽链骨架（图9.14）。枯草杆菌蛋白酶属于另一蛋白酶家族，在古生菌、细菌、和真核生物发现了这一蛋白酶家族成员。图9.14枯草杆菌的催化三体和氧负离子洞。氧负离子洞的两个氨基分别来自肽链骨架氨基和Asn155的侧链氨基。这两个氨基能够稳定活性中心Ser221亲核攻击肽键碳原子所形成的氧负离子。小麦羧肽酶II有催化三体，但是这个酶与胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶都没有明显的类似性（图9.15）。图9.15羧肽酶II。小麦羧肽酶II的结构（右边），有两条肽链（分别用蓝色和红色标出）。活性中心的催化三体（左边）与胰凝乳蛋白酶的组成相同。但是该酶与胰凝乳蛋白酶没有相似之处。形成氧离子洞的氨基酸残基用黄色涂出。该蛋白质属于另一蛋白家族，包括乙酰胆碱酯酶和脂质酶。在这些酶中，用组氨酸活化的亲核试剂可能是半胱氨酸而不是丝氨酸。最后，还有一类蛋白酶活性位点的丝氨酸或苏氨酸不是用天冬氨酸-组氨酸对活化，而是用赖氨酸侧链氨基或肽链N-端氨基活化。因此，蛋白酶活性中心的催化三体在进化过程中产生的时间点至少有三个。这类催化策略在水解肽及相关化学键方面尤为有效。定点突变研究定点突变也能研究氧离子洞对催化反应的重要性。Asn155突变成甘氨酸能消除枯草杆菌氧负离子洞的一个氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加两倍。这些结果显示天冬酰胺的NH基团在稳定羰基碳四面体中间物以及形成该四面体的转化态方面起重要作用。其他种类的肽水解酶:半胱氨酸蛋白酶组氨酸残基活化半胱氨酸，后者亲核攻击肽键（与丝氨酸蛋白酶的丝氨酸相似)。木瓜蛋白酶(papain)是研究最深入的半胱氨酸蛋白酶。与该酶同源的哺乳动物蛋白酶有组织蛋白酶（cathepsins)，在免疫系统和其他系统起作用。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，负责细胞凋亡，但是Caspases的结构与木瓜蛋白酶没有关系。因此在进化过程中，半胱氨酸蛋白酶至少独立出现两次。其他种类的肽水解酶:天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶活性位点中心有一对天冬氨酸，联合作用活化水分子，后者攻击肽键。一个天冬氨酸去质子，攻击水分子（使之脱去质子）。另一个天冬氨酸有质子，极化肽键使肽键对亲核攻击敏感。这类蛋白酶包括肾素，HIV蛋白酶。其他种类的肽水解酶:金属蛋白酶活性位点有金属离子（几乎都是锌离子）。金属离子活化水分子，后者亲核攻击肽键的羰基。嗜热细菌蛋白酶（thermolysin）和消化酶羧肽酶A是锌离子蛋白酶。嗜热菌蛋白酶是锌蛋白酶家族成员。这个家族很大，包括基质金属蛋白酶（负责组织重构和组织降解）。但是羧肽酶A不属于这一家族。讲到此.图9.19HIV蛋白酶是二聚体天冬氨酸蛋白酶。两个亚基完全相同（分别用蓝色和黄色表示）。每个亚基（有99个氨基酸）给活性位点提供一个Asp。底物结合后关闭结合口袋的扇翼结构。图9.20Indinavir是HIV蛋白酶抑制剂。Indinavir(crixivan)的结构与HIV蛋白酶底物多肽的结构比较。底物断裂化学键用红色标出。Indinavir的醇与四面体中间物很相似，其它基团与酶分子识别位点S2,S1,S1’,和S2’结合。在活性位点，indinavir采用的构型接近于酶蛋白的二重对称结构。结合抑制剂后可变翼盖住HIV蛋白酶活性位点。抑制剂中心醇羟