植物组织切片制作以及注意事项

植物组织石蜡切片的制作以及注意事项1植物组织石蜡切片的制作方法⑴固定：用50%或70%FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1;幼嫩材料用50%FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24h。⑵脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30min；重复一次，室温静置20min。换成1%番红O溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。次日继续脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80%乙醇1h、95%乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。⑶透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40min（2次）。最后加入少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。⑷浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。⑸包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止气泡产生，以及凝蜡不匀。⑹切片：修整蜡块，用LicaRM2126切片机切片，厚度5-10μm。⑺贴片:在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最后置于37℃恒温箱过夜烤片。⑻脱蜡及染色：①番红-固绿对染ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、80%乙醇5min、1%番红室温过夜。ⅱ染色：80%乙醇5min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5min（2次）。②甲苯胺蓝染色ⅰ脱蜡：二甲苯60min、二甲苯5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、80%乙醇5min、70%乙醇5min、50%乙醇5min、30%乙醇5min、蒸馏水5min。ⅱ染色：用0.2-1%甲苯胺蓝染色1-10min，自来水冲洗30s、95%乙醇分色大约20s、无水乙醇脱水2次，各5min、二甲苯透明2次，各5min。③I2-KI染色淀粉颗粒ⅰ脱蜡：同甲苯胺蓝染色脱蜡ⅱ染色：I2-KI10min，快速用三氯乙烷冲洗，自来水冲洗30s、无水乙醇脱水2次，各5min、二甲苯透明2次，各5min。⑼封片：从二甲苯中取出后，立即在载玻片上滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，放至37℃恒温箱中烤片。⑽镜检：将组织切片置于MoticB5professionalseries光学显微镜下(BockOptronicsInc.,Canada)观察,并用MoticImagesAdvanced3.1软件显微拍照。2注意事项（1）样品的采集以及固定样品采集时，必须迅速，大小要均匀，不能太大。采集完后立即放入固定液中固定。石蜡切片样品固定液通常选择FAA固定液，其中幼嫩材料用50%FAA固定，较老的材料用70%FAA固定。为了使固定液能够完全渗入组织，方便后面的脱水彻底，使得蜡完全浸入组织，通常采用注射器将材料组织完全抽为真空，使得组织下沉。然后将组织从注射器中轻轻的移入小青霉素瓶中，换上新鲜的固定液。在青霉素小瓶贴上白色医用胶带，用铅笔上做上标记，切忌用记号笔做标记，因为在以后的操作中，小瓶要接触到乙醇，容易将标记抹去而模糊消失。（2）脱水和透明依次严格按照操作步骤，乙醇浓度和脱水时间脱水。每次不同梯度酒精脱水完后，将青霉素瓶倾斜，慢慢倒掉酒精液体，避免瓶子里的组织随液体一起倒出来，假如担心，最好底下放一个培养皿接着，如有倒出，则流在皿里面，容易观察到，可以重新放在瓶中。如果不能顺利的将瓶子里的脱水酒精倒干净，则建议找一个橡胶洗头，套上1ml枪头，将里面的液体全部吸出。这样也避免用枪吸，有机溶剂腐蚀枪而使得枪受到破坏。当重新换完下一梯度的脱水酒精时，一定要检查是否有组织粘在瓶壁上，而没有浸泡在脱水液体里，使得脱水不干净。当脱水至纯酒精和二甲苯时，一定不能让组织在就酒精中停留的时间太长，时间一长容易使得组织变硬变脆，此时以及以后的操作的步骤中，动作一定要轻缓，任何操作仪器一定不能碰到组织。第2次二甲苯透明结束时，倒掉瓶中的大部分二甲苯，留底部的液体在。然后给瓶子倒入事先准备好的碎末固体蜡，在试验台蹦实，使得组织完全包埋在碎蜡里。放在37度恒温箱过夜。这样做的目的是因为植物组织有细胞壁，石蜡不容易浸入组织，因此需要足够长时间的浸蜡。（3）浸蜡次日将恒温箱调至56度后开始计时，浸蜡。1h后倒掉瓶里的石蜡，换上新鲜的纯石蜡，必须要过滤，并且温度不能太高或者太低。换下的蜡里由于含有事先残留瓶中的二甲苯，必须将其中的二甲苯挥发掉，才能使用，因为石蜡里假如含有二甲苯的话，会使得石蜡凝固后变软。一旦包埋了组织，切片是由于蜡软不易切片。消除石蜡里二甲苯的方法时，将蜡在电炉上煮，二甲苯将变成气泡，而挥发掉，直到液体石蜡不再产生气泡。还有一点值得提出的是，新买的蜡，首次融化凝固后，也容易产生白点沉淀，不能用来包埋组织。因此也要反复熔化-凝固，过滤，直到凝固的蜡，表面光亮，没有白点才能用。在浸蜡过程中，在按照步骤所定的温度，即使调节温度和换蜡外，还有实时观察恒温箱中瓶中的腊，不能让其凝固。假如凝固，即使升温将其熔化。（4）包埋事先应该先准备的东西有：小纸盒（按照材料的大小，和多少规定纸盒的大小，装液体蜡和组织材料），酒精灯和解剖针（迅速将组织倒入纸盒中，用在酒精灯中烧热的解剖针快速，摆正组织在纸盒中的位置，方便后续的修块和切片）冰水（里面加入一定的冰，尤其是夏天的时候，目的是完了让蜡块迅速冷却。但是里面放的并不能太多，一旦纸盒接触到冰，容易使得蜡块产生裂缝，而断裂），将倒入组织和蜡的纸盒放入冰水中冷却时，一定不能让水进入纸盒，否则会使得凝固的腊产生裂痕。（5）修块和切片，粘片以及烤片修块：将带有组织的蜡块用刀片修正成正方形或者长方形，然后在木块上滴入熔化的石蜡，将组织块占在上面，四周都滴上石蜡，将组织粘牢固。放入冰块中，让其迅速冷却，最后用刀片再次修块，四边都要平行，只留下有组织的很小横截面，这样在切片时，面积较小，减少刀片的损坏，还有面积太大，切片是容易打折起皱。切片：将木块固定在切片机上切片，调整好角度，开始切片。在刚开始时，也许组织还没有从蜡里面露出，或者不是你想要切的组织，这时你可以将切片机的切片厚度调整的厚些，迅速先切到你想要开始切的部位，然后在调整成石蜡切片所要的厚度：4-7微米。在正式切片时，一定要用力均匀，不能太快，否则由于石蜡尤其夏天气温高较软，切片上的组织会被压缩，使得细胞变形。切片能切厚（7-8um）就不要切薄（3-4um），除非情况万不得已的情况下，因为厚度变薄也会使得细胞变行，但是也不能太厚，一来在粘片是粘的不牢固，容易掉片，二来是在观察下在高倍镜下变得很模糊，不清楚，这些指针对于较硬的植物组织，比如种子。值得注意的是，我们实验室的莱卡切片机一旦换了新的一次性刀片，切片时，蜡带起卷，很难成带。本人通常的做法是：不断调整大片的位置，一般将刀片右端突出切片机些，这样的位置，再加上在厚度较薄下切片，切片速度要很快，这样容易使得蜡带。以后就可以顺利的切片了。粘片：通常采用捞片法。要注意的是：一，在捞片时，将蜡带的糙面朝上，和水面接触的光面。否则相反的话，蜡带在载玻片上粘的不牢固，容易脱片。二，水温不能太高，水温高的话，蜡带的张力变大，使得组织变形，出现断裂，破坏组织。烤片：通常在37度过夜。但是根据经验，在65度，3h也可以烤片，并且更加粘片牢固些。6染色和封片按照上面进行的同时，要注意的是：一，一旦组织脱蜡，组织就没有蜡起着固定作用了，假如在操作过程动作很夸张的话，很容易会使得载玻片上的组织脱落，或者组织细胞变性，变散，所以动作一定要轻，轻拿玻片，轻放玻片。二，在封片是，要迅速，不能让组织上的二甲苯变干，此外，滴上树胶后，放入盖玻片，假如盖玻片的位置不对，也不能推移盖玻片，因为一旦移动盖玻片，玻片上的组织细胞立即会散的，变性。因此要将盖玻片放对合适的地方，要靠实验者的操作技巧和熟练程度。