植物组织培养复习资料(精缩版)

绪论课程基本情况植物组织培养：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养并使其发育成完整植株的科学技术。简称组培。也称离体培养或试管培养。理论依据——植物细胞全能性：任何有完整细胞核的植物细胞，具有全部的遗传信息，在一定条件下均具有发育成一个完整植株的潜在能力。动植物细胞分化差异。植物细胞全能性必须满足的条件：1、要使这些细胞处于离体条件下，解除植物体其余部分对这些细胞的抑制性影响；2、要给予它们适当的刺激，就是给予它们一定的营养物质和激素的作用。植物组织培养过程（无菌环境操作）：外植体→（脱分化）→愈伤组织→（再分化）→试管苗→→植株外植体（离体器官）：由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官（包括胚、芽茎尖、叶、花瓣等）。初代培养：指外植体的最初培养。继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中进行再培养，称为继代培养脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞经过离体培养，产生无结构的愈伤组织或细胞团的过程。再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化出根或芽等器官的过程。组织培养类型：根据所培养的植物材料的不同：组织培养；细胞培养；器官培养；胚胎培养；原生质体培养愈伤组织：原来是指植物在受伤之后，在伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，它是指在培养基上由培养物产生的无序的薄壁细胞团。愈伤组织培养：将一个细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过去分化形成愈伤组织，并在体外培养使之再分化成植株的技术。（最常用）悬浮细胞培养：不断搅动或摇动的液体培养基中培养单细胞或小细胞团的培养方式。（主要目的生产有用产物）。器官培养：对植物的根、茎、叶片、花器等各个器官进行离体培养。（用于苗木快速繁殖）。茎尖分生组织培养：使用茎尖无病毒分生组织为材料进行培养。（脱毒培养）。原生质体培养：去除细胞壁、裸露的原生质体的培养。（创建种间或属间新品种）。根据培养过程：初代培养；继代培养；生根培养：根据培养基的物理状态（培养条件）：固体培养；液体培养；半固体培养；双层培养：器官再分化两种方式：器官发生型；胚胎发生型器官发生型：由愈伤组织不同部位产生不定芽或不定根，通常是单极性。胚胎发生型：由愈伤组织产生胚状体或称体细胞胚，胚状体是双极性，芽根之间有维管束连接，可独立生长成完整植物体。组培模式：培养基模式（MS,White,B5,N6）；激素调控模式（CTK/IAA）。组培优点：①培养条件可以人为控制；②生长周期短，繁殖率高；③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制组培的应用及前景：(1)理论研究方面的应用：研究细胞分化和器官建成响应因素的主要方法。(2)快速繁殖：离体诱导不定芽分化和促进腋芽增殖。(3)脱毒培养：离体茎尖培养技术可脱除病毒，解决无性繁殖植物品种退化(4)人工种子制备：通过诱导体细胞胚（胚胎发生）(5)次生产物的生产：有用化合物的工业化生产。(6)植物种质资源的保存和交换；(7)遗传操作上的应用：①突变体的筛选：用诱变因子（射线或化学物质）诱变愈伤或悬浮细胞，可提高诱变率，可筛选出一些优良品种。②离体授粉及胚胎培养：克服远缘杂交的不亲和性（受精前、后的障碍）。③原生质体融合：可获得有性杂交不能产生的杂种；产生细胞质杂种。④单倍体的诱导：花药培养技术可缩短杂合体纯合时间，加速育种进程。⑤遗传转化：基因工程不可缺少的部分。组培发展阶段：开创；奠基；建立时期。第一章实验室与基本操作组培实验室组成：洗涤室（准备室）；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等。//准备室；无菌操作室；培养室；细胞学实验室；温室。//准备室；无菌操作室；培养室；温室。灭菌装置：①高压蒸气灭菌装置；②细菌过滤器超净工作台工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气缓缓通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。实验基本设备：①器皿和器械（玻璃器皿；器械类）；②仪器设备基本操作：洗涤；灭菌；无菌操作。洗涤方法：重铬酸钾洗液洗涤；洗涤剂洗涤；超声波洗净器洗涤（要加水）。灭菌方法及适用范围：1、干热灭菌：鼓风干燥箱（烘箱），150℃，120min。玻璃器皿.2、湿热灭菌：高压蒸汽灭菌，121℃，0.1MPa，15～20min。培养基灭菌.3、熏蒸灭菌：药物熏蒸。培养室、接种室灭菌.4、过滤灭菌：使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，然后在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。液体培养（不耐高温活性物质）5、药剂灭菌：70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠等药剂灭菌。培养材料灭菌。6、烧灼灭菌：酒精灯烧灼灭菌。接种器具灭菌。7、射线灭菌：紫外线照射灭菌，照射时间一般为15～30min，接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。培养基的构成（维持离体细胞生存和生长的溶液）：1、水、无机盐、PH：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。2、有机化合物：①有机碳源：即糖类。（作用：维持渗透压；提供碳源和能量；防止幼胚早熟；影响组织分化类型（高浓度分化出韧皮部，低浓度仅长出木质部，浓度适中二者兼有））。②维生素类：（作用：直接参与生物催化剂（酶）的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要生命活动。）③有机含氮化合物3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。生长素的主要作用：诱导外植体脱分化产生愈伤组织；促进培养物生长；诱导根器官的分化。细胞分裂素主要作用：促进细胞的分裂和分化；诱导不定芽和胚状体的分化和形成；延缓组织衰老；增加蛋白质合成。4、附加物类、凝固剂：琼脂（做支持物），琼脂糖（改善通气状况），PVP、Vc、硝酸银、活性炭（防褐化）、椰乳，马铃薯萃取液等。培养基的基本类型及特点：1、含盐量较高的培养基，特点是：无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富。元素平衡较好，缓冲性能好。微量元素和有机成分含量齐全且较丰富，目前应用最广。如MS培养基。2、硝酸钾含量较高的培养基，特点是：培养基盐类含量较高，铵态氮含量较低，但盐酸硫胺素和硝酸钾含量较高。如B5、N6、SH培养基。3、中等无机盐含量的培养基，特点是：大量元素含量约为MS培养基的一半，微量元素种类少但含量较高，维生素种类较多。如Nitsch培养基、H培养基。4、低无机盐含量的培养基，特点是：无机盐含量非常低，为MS培养基的1/4左右，有机成分也很低。如White（怀特）培养基、WS培养基、HE培养基。培养基的划分：（一）常用的培养基：MS培养基；B5培养基；White培养基。（二）按试验目的分为：诱导培养基，继代培养基，分化培养基，生根培养基。（三）按物理性质分为：固体培养；液体培养；液体培养又分为静止培养和振荡培养（培养物在培养过程中可均匀接触吸收培养基成分；可以保持良好的通气条件）培养基的筛选：筛选；调整。培养基的制备：母液的配制；培养基配制配制母液注意几点：（低倍数、冷藏、现配）1、配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。2、母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。3、母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和微生物污染。建立离体培养体系的基本程序：无菌外植体的获得；初代培养物的建立；形态发生和植株再生外植体选择的基本原则：再生能力强；遗传稳定性好；来源丰富；易灭菌；大小适宜。培养材料的灭菌要求：①消灭病菌②减少对材料的损伤材料灭菌过程：材料前处理、消毒液处理（程序:75%酒精30s，0.1%升汞消毒5～30min）、无菌水冲洗。污染主要类型及特征：1、细菌：菌斑粘液状。在材料基部挨着培养基的部位，一般短时间内可以观察到。1-3天。2、真菌：有颜色的霉菌。时间较长才能看到。10-30天之后出现。污染的控制措施：（内外两方面考虑）1、操作环节：①改善环境条件;②严格执行无菌操作;③严查接种材料;④经常检查灭菌设备的质量;⑤检查培养容器是否存在问题。2、内源细菌：①培养基中加入杀菌剂;②反复茎尖培养;③降低PH值第二章植物离体繁殖植物离体繁殖：利用组织培养技术对外植体进行离体培养，短期内获得遗传性一致的大量再生植株。也叫快繁或微繁。快繁突出特点：1、繁殖效率高;2、培养条件可控性强;3、便于管理、占地面积小;4、利于种质资源的保存及交换。快繁的应用：1）短期内获得大量形状优良、整齐一致的种苗群体。加快引进新种、新育良种的繁殖，促进优良品种推广和应用。2）大量繁育原来常规方法不能进行无性繁殖、难繁殖和繁殖速度慢的一些植物，尤其对一些珍、稀、濒危的植物的繁殖有更重要的意义。3）作为培育新品种的有效手段，繁殖和保存育种材料。4）通过茎尖培养等技术脱毒，扩增脱毒苗，达到提纯复壮良种的目的。快繁的器官形成方式1、短枝发生型；特点：一次成苗，过程简单，易成活，遗传性状稳定。2、器官型（丛生芽发生型）；特点：由单芽到丛芽，繁殖速度快，遗传性状稳定。3、器官发生型（不定芽发生型）；特点：繁殖速度快，由愈伤组织再生植株，遗传不稳定。4、胚胎发生型；特点：发生数量大，速度快，结构完整。5、原球茎发生型；茎尖或腋芽外植体通过形成原球茎，而发育为完整植株，应用于兰花。快繁程序：无菌母株的制备，继代芽的增殖，芽苗生根培养，再生植株的锻炼和移栽。1、无菌母株的制备初代培养：选取遗传性状优良、稳定，生长健壮、无病虫害植株上的外植体，经适当有效灭菌处理后，接种在培养基上，诱导其产生芽（腑芽或不定芽）和愈伤组织。初代培养的启动生长方式:腋芽被刺激后生长；茎段、叶片、其它器官伤口处产生不定芽；外植体切口产生愈伤组织。2、继代芽的增殖无菌母株再次切割继代培养，芽分化增殖成丛芽，加快繁殖速度。在快速繁殖过程中，随培养时间和继代次数增加，芽分化和生长速率降低，称为驯化现象，与内源激素和恒定培养条件有关，故可以调节激素配比或变温处理，提高繁殖速度。3、芽苗生根培养诱导无根苗生根的方法有两种：试管内生根和试管外生根。1）试管内生根：将无菌小枝条转入生根培养基中进行培养。提高生根率的措施：①降低无机盐和有机物含量；②适当提高生长素的浓度，降低细胞分裂素的浓度。；③降低渗透压；④暗培养。2）试管外生根：有些植物可以在离体条件下形成的枝条，在基部切口处用生根粉或与滑石粉混合的IBA涂抹，然后种植到温室或田间中，这样的方法可大大降低成本。4、再生植株的锻炼和移栽（移栽过程要注意的一些问题）1）将小苗根系周围的培养基冲洗干净，以避免有害微生物的污染。2）筛选适宜的移栽基质；3）选择使用营养钵、苗床或塑料薄膜以及遮阳网，以调控光、温、湿度等。4）注意移栽前后培养条件的改变。移栽后植株死亡的原因:1）根系结构不完善：不生根（木本植物）、根与芽的输导组织不相通（愈伤组织）、再生根的吸收功能差。2）叶部结构不完善：缺少角质层或蜡质层，保水性差；缺乏叶表皮毛，保湿、反光性差；气孔开度过大，关闭能力差；叶片中栅栏组织发育不完善，光合能力低。克服这些因素的方法：培育壮苗：培养基中加入适宜的生长延缓剂（多效唑、矮壮素、B9等）。炼苗：1）日光锻炼；2）湿度锻炼；3）温度锻炼；4）闭瓶炼苗与开瓶炼苗相结合。快繁中的问题：一、污染；（原因：培养基及器具灭菌不彻底，操作的人为带入，环境不清洁）二、遗传稳定性；（控制：减少培养基中容易诱导变异的物质、定期清除不正常的组培苗）三、玻璃化：是指由于试管苗发生生理失调，而形成的发育不正常的组培苗。常常表现为叶片皱缩、易碎、嫩叶呈水浸透明状。移栽后常死亡。原因：培养基中琼脂与蔗糖的浓度低、细胞分裂素与生长素比例失调、培养基中含氮量高、培养温度高、光照不足防止措施:1、加入琼脂提高培养基硬度；2、提高蔗糖含量，降低培养基的渗透压；3、减少含氮成分、降低温度或变温处理、提高光照；4、添加抗玻璃化的化学物质：活性炭、聚乙烯醇、多效唑、青霉素等。四、褐化：是指培养材料向培养基中释放褐色物质，使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。本质：酚类物质在多酚氧化酶的作用下，氧化形成褐色的醌类物质，导致植株中蛋白质变性、酶失活。影响因素：1、植物的品种与种类；2、外植体的生长发育时期、