上转换荧光材料在化学生物中的应用

基于上转换荧光纳米材料在化学生物中的应用摘要：稀土掺杂氟化物上转换纳米材料因其特有的发光性能，使其在生物能源、化学、生物医学、光电子动力学等领域已经获得了广泛而重要的应用。本文对上转换纳米材料就当前的修饰、化学无机物的检测，以及在生物分子检测，生物成像标记，免疫分析，疾病诊断等方面的最新研究进展做一综述，并讨论了上转换材料在化学生物领域的应用前景。关键词：上转换；无机物；生物分子；成像；标记；免疫；疾病诊断；综述1引言上转换纳米材料是一类比较特殊的稀土掺杂无机发光材料，它可以通过多光子机制将近红外光转换成短波辐射，发射出紫外或者可见光，即anti-Stökes发光。该类材料具有如下诸多优点[17,40]：①化学稳定性良好，发光过程几乎不受温度、湿度、pH等的影响；②光化学稳定性好，长时间在强光或激发光照射下仍具有很高的光学稳定性，且不易被光解；③上转换发光材料发光是anti-Stökes发光，其激发波长一般是近红外或红外光，而在生物体系中，大部分干扰物不会被激发，降低了检测背景，使得灵敏度获得很大的提高；④上转换发光材料的近红外或红外激发光波长长，能量低，所以可以很好的穿透一些生物组织而不会对其产生伤害；⑤上转换纳米材料是稀土掺杂材料，这相比于一些常用的荧光染料，价格低廉。而且其激发光源采用的是廉价高效的980nm红外激光器，检测装置比较简单；⑥发光波长可调。例如选择NaYF4作为基质，合成过程中掺杂不同的稀土离子可以得到不同颜色的发射荧光。从以上优点可以看出上转换纳米材料是一类非常优越的生物标记材料。目前稀土发光上转换纳米材料的制备方法很多，主要有共沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法、燃烧法、喷雾热解法、气相沉积法等。只要合理调控掺杂离子，这些合成手段都可扩展到制备上转换。然而，为了满足尺寸、形貌可控、上转换发光效率高及生物应用的要求，目前发展了一些有效的方法来制备上转换，主要有油酸或者亚油酸协助的水热合成法、三氟乙酸稀土盐热分解法、液相共沉淀法。如果在合成过程当中加入一些金属、非金属或高聚物还能获得一系列方便使用、更多性能的上转换材料。目前上转换荧光纳米材料在很多领域已经获得广泛应用。通过对其掺杂一些其他物质，譬如金属，氧化物，非金属及高分子有机物，或在其合成后对其表面进行层层组装等修饰而获得了一系列具有很好水溶性和生物相容性的光敏材料。经过修饰后的材料设计成各种生物传感器已广泛用于化学无机物的检测，以及生物分子检测，生物成像标记，免疫分析，疾病诊断等领域。本文主要基于上转换材料的应用，综述了今年来上转换材料在生物传感器等领域中的各种应用并讨论了其应用前景。2上转换荧光纳米材料在化学、生物中的应用2.1上转换材料的表面修饰在诸多的合成方法中，大多数合成后表面通常是疏水的有机配体，导致他们不具有水溶性和生物相容性。要对上转换用于化学生物研究必须对其进行修饰，使其表面带有一定的亲水基团，例如氨基、羧基、醛基、巯基等。当这些基团修饰上去之后，上转换材料不仅具有一定的相容性，还能更方便的和其他物质进行连接，进一步做成生物传感器，用于化学、生物领域的多种应用。表面氨基的修饰方法：SiO2包裹法是比较成熟，使用比较广泛的氨基修饰方法。其大概修饰过程是在含有上转换的有机溶剂中，依次加入氨水、水和正硅酸乙酯（TEOS）从而得到硅包裹的上转换，然后加入溶解在有机溶剂的氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），最后得到表面氨基修饰的上转换。另外通过使用PAH对上转换进行层层组装得到表面带氨基的上转换材料。Wang等用聚乙烯亚胺(PEI)为稳定剂和表面修饰剂，在乙醇和水的混合溶剂中合成出粒径在50nm左右、表面PEI修饰的NaYF4：Yb，Er／Tm上转换纳米颗粒。上转换表面羧基的修饰主要有配体交换法、直接合成法，层层组装法、配体氧化法等。Chow课题组利用两端为羧酸的聚乙二醇取代上转换表面的油胺配体，制备了亲水性的、羧酸功能化的上转换，配体上自由的羧酸可用于连接生物分子。另外使用聚丙烯酸（PAA）对上转换进行后修饰或者在合成中使用PAA做稳定剂和包裹剂，对在合成中加入PAA的上转换，其表面羧基进行活化就可以进一步加以应用。另外在APTES修饰的上转换溶液中加入PB（pH11.0）适量缓冲溶液溶解后的琥珀酸酐也可以得到羧基修饰的上转换。配体氧化法对上转换进行羧基修饰就是利用Lemieux-vonRudloff试剂(KMnO4+NaIO4水溶液)将上转换表面的油酸配体氧化成壬二酸配体从而得到亲水性的、羧酸功能化的上转换材料。上转换表面醛基和巯基的修饰：其修饰过程是在臭氧存在的特定条件下直接氧化其表面的油酸从而使其表面带有羧基或醛基。这种氧化修饰过程对上转换的形态、组成、光学性能没有太大影响。其巯基的修饰过程就是在醛基的基础上加入巯基乙胺（HEMA）从而获得巯基修饰的上转换纳米材料。另外为了满足需要，比如在应用过程中需要对目标物进行分离、提高上转换的光学性质，因此引入了无机壳层修饰法。一般是采用无机物（Ag、Au等）为壳来钝化量子点的表面，这样能大大提高了量子点的荧光量子产率，从而使量子点具有较强的荧光发射。或者在合成后的上转换材料表面在包裹一层磁性Fe2O3，实现了在检测过程中对目标物的分离定性。在上转换材料中掺杂一些碱土金属离子（Li和K），根据碱土金属的数量可以调制上转换的荧光。2.2基于上转换材料传感器检测无机物利用上转换纳米荧光材料做成的传感器实现了对一些重金属离子及有害无机阴离子的检测，并且还应用于生物体内的离子成像等。Zhang等把氨基修饰的DNA通过共价键连接在羧基修饰的上转换纳米材料上，然后加入染料和Hg2+，利用DNA与Hg形成T-Hg-T结构的原理把染料嵌入其中，从而实现了上转换与染料之间的共振能量转移达到检测Hg2+的目的。Liu等首先通过化合物N719与上转换表面的油胺（OM）链交换，当Hg2+加进去结合到化合物N719上，实现了上转换与化合物N719之间的能量转移，这种传感器达到了对Hg2+1.95ppb的检测限，并且还能应用于体内Hg2+的成像。Zhou等设计一种对Ce4+离子检测的传感器。达到了5×10-6mol/L至5×10-4mol/L的检测范围。Zhang等利用上转换与RB-酰肼设计了一种检测Cu2+的传感器，该种检测Cu2+的方法无荧光背景干扰，容易操作且具有很好的选择性。Chen等通过sulfanilamide与NO2-、N-(1-naphtyl)-ethylenediaminedihydrochloride(N1NED)在酸性条件下形成在550nm有强烈吸收的化合物4-((4-(2-aminoethylamino)naphthalen-1-yl)diazenyl)benzenesulfonicaciddihydrochloride(ANDBS)，然后使其连接到上转换材料上利用ANDBS对荧光的猝灭实现了对痕量NO2-的检测。Liu等利用含钇的发色团包裹的上转换利用在加入CN-之后上转换荧光的复现原理实现了对CN-的检测，并用于体内CN-的成像。Yao等同样利用钇化合物修饰的上转换基于其LRET原理成功检测了纯水中的CN-。Heike等把苯酚红和上转换固定在聚苯乙烯材料中，利用氨的特定穿透性质设计了检测氨的传感器。Xie等利用双荧光的上转换纳米棒设计了对体内pH和金属离子的检测。Sun等基于BTB在不同pH中具有不同强度可见光吸收，利用上转换荧光纳米棒设计了检测范围在6-10的pH传感器。DanielaE.Achatz把上转换和氧探针固定在乙基纤维素（EC）当中，利用氧较强的渗透EC的能力做成了检测氧的传感器，该对氧的传感器避免了生物体内荧光背景干扰。RehamAli等基于含有上转换材料和长波长吸收的pH探针BTB的聚苯乙烯薄片的光学讯号，设计了检测CO2的传感器，该传感器对CO2的检测范围为0-3%。GarryGlaspell等将2,4,6-三硝基甲苯（TNT）加入到抗体连接的上转换和染料构成的传感器中，利用TNT替代淬灭剂利用上转换荧光复现检测了TNT。2.3上转换纳米材料传感器对生物分子的检测2.3.1上转换对核酸的生物传感Wang等首先用探针DNA包被的磁性纳米粒子和捕获DNA包被的绿色上转换纳米材料共同与目标DNA进行杂交，然后磁分离实现对目标DNA的检测。另外，利用mRNA进行反转录并通过处理后得到生物素修饰的cDNA，cDNA与目标DNA进行杂交然后通过链霉亲和素与生物素修饰的上转换纳米材料进行共价结合得到一类检测DNA的传感器。ShanJiang等把染料BOBO-3或POPO-3嵌入杂交后的siRNA、质粒DNA中，与修饰后后表面带正电荷的上转换纳米材料通过静电作用实现了上转换与染料之间的能量转移从而获得一类检测核酸的传感器。Zhang等首先把适体DNA连接到上转换上，该DNA与另一条染料修饰的DNA共同和目标寡核苷酸进行杂交，利用上转换与染料TAMRA之间的能量转移达到检测目标核酸的目的。同时他把单链DNA共价连接到上转换上，当加入目标DNA和染料时，染料嵌入DNA双链中，利用上转换和染料之间的能量转移也得到一类检测DNA的传感器。MoritzM.Rubner等把叠氮丙基三乙氧基硅烷修饰在上转换纳米材料表面，然后与乙炔基修饰的单链核酸进行连接做成了可以识别互补DNA及非特异性的交联细胞膜的水溶性材料并用于了细胞成像。Minna等利用上转换荧光标记技术检测了寡核苷酸并标记了遗传人体腺病毒。2.3.2上转换对蛋白质类生物分子检测张等利用氨基修饰的上转换作为能量供体，带有羧基的藻红蛋白作为受体，利用共振能量转移实现了对藻红蛋白的检测，该传感器对藻红蛋白达到了0.5µg/ml的检测限。Wang等用碳球作为能量受体，上转换作为供体，基于二者之间FRET原理先后设计了检测凝血酶你和金属蛋白酶的传感器。Wang等利用生物素修饰的上转换纳米粒作为供体和AuNPs作为受体，设计的检测抗生物素蛋白的传感器。TerhiRantanen等利用染料对上转换的荧光猝灭设计了检测核苷酸内切酶和水解酶活性的生物传感器。2.3.3上转换对其他生物分子的检测由于上转换纳米材料在生物的检测过程中不产生氧化物中间体，因此在生物领域具有其特有的优势。Song等把抗生物素蛋白修饰在上转换表面使其与生物素修饰的适体主链DNA连接，该适体链与带染料TAMRA的DNA杂交，当ATP加入时利用其荧光恢复实现对ATP的灵敏检测。Liu等利用单链DNA与石墨烯的特定作用，以石墨烯为能量受体也设计了一种检测ATP的传感器，使其检测限达到0.5µM。Zhang等把伴刀豆蛋白修饰在上转换材料上，把壳聚糖固定在石墨烯上，构建了从上转换到石墨烯能量转移检测葡萄糖的传感器。Deng等把KMnO4还原后得到的MnO2纳米片固定在上转换材料上，谷胱甘肽把MnO2还原使之变成Mn2+离开上转换表面从而实现了对谷胱甘肽灵敏检测。KatriKuningas等利用抗体、染料、上转换纳米材料构建了一种检测雌二醇的生物传感器。TerhiRantanen等基于串联染料受体和上转换纳米材料之间的FRET原理构建了同质生物亲和性分析的传感器。2.4上转换纳米材料在免疫分析中的应用上转换纳米荧光材料也广泛用于抗原抗体分析，其传感器用于多种细菌、霉素的检测。基于抗原抗体的特异性结合，该类传感器不仅用于细胞成像，生物标记，也用于作为中间连接体检测其他物质。其一般过程是首先用Si、PEI或PAA修饰上转换纳米颗粒，再在其上连接抗原或抗体使其具有生物相容性或获得与其他物质的特异性结合位点。Wang等把人类免疫球蛋白G（IgG）固定在氨基修饰的AuNPs上，并以此为受体，把兔抗山羊IgG固定在氨基修饰的上转换纳米材料上，当加入山羊抗人IgG时，在AuNPs和上转换纳米粒之间构成了LRET系统从而实现了检测山羊抗人IgG。图：NaYF4：Yb，ErUCNPs(供体)和AuNPs(受体)之间的共振能量转移原理示意图SchematicIllustrationfortheLRETPr