动物微生物学中常见的病毒和细菌病诊断

陈双钊一常见的致动物疾病性病毒狂犬病病毒狂犬病病毒（Rabiesvirus）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是引起人和动物狂犬病的病原，该病在世界各地均有发生。一、生物学特性病毒子长140～180nm，宽75～80nm，一端钝圆，另端平凹，呈子弹头形或试管形。在螺旋对称的衣壳中，含有负股单股RNA。具有脂蛋白的囊膜，在膜上有血凝素的穗状突起。该病毒只有一个血清型。二、抵抗力病毒在pH为7～9的范围内比较稳定，在56℃经30min可使病毒灭括。五、致病性狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血脊椎动物，同样也能感染人。本病主要由患病动物咬伤后而感染。当健康动物皮肤粘膜有损伤时，接触病畜的唾液亦可以感染。病犬的唾液于症状出现前1～2周便可能会有病毒。存在于病畜唾液中的病毒，通过咬伤而进入易感动物的皮下组织，然后沿着神经纤维由外周进入神经中枢。也有人认为病毒是由外周经血液侵入脑组织。病毒在脊髓和脑组织中增殖，并可按离心方向由中枢神经向外扩散，而脑脊髓液在病毒扩散中，亦起着重要作用，使所有器官都能查出病毒。抵达唾液腺的病毒，在其上皮细胞内又大量增殖，并进入到唾液中。病毒在中枢神经系统中的继续繁殖，损害神经细胞和血管壁，引起血管周围的细胞浸润。神经细胞受刺激后，首先引起兴奋症状，如神经紊乱和反射性增高，后期神经细胞变性，逐渐引起麻痹，当呼吸中枢麻痹后即可造成死亡。六、微生物学诊断常用的特异性检查方法有包涵体检查，动物试验，荧光抗体检查等三种。（一）包涵体检查取大脑、小脑，特别是海马角部分，用刀片切开印片，趁印片未完全干燥时，以塞勒（Seller）氏液染1～5s，水洗、干燥、镜检。内基氏小体呈鲜红色、间质呈粉红色、红细胞则为桔红色。内基氏小体为圆形、卵形、核形、阿米巴形。大小为24～27μm，位于细胞浆内。用姬姆萨氏（Giemsa）染色，小体为红色（图10-1）。由于有些犬、猪和草食兽的病例及病初死亡或早期剖杀动物中可能不见包涵体，所以并不是所有的病例都能检查出包涵体来。（二）动物试验实验动物如小白鼠、豚鼠、家兔等都可用于诊断，其中以小白鼠最为敏感和经济，并可提高阳性检出率。按照病毒的培养方法，给小白鼠脑内接种，每只0.03ml。接种后观察21d，5d内死亡者淘汰；5d后发病者，当出现松毛、颤抖、后肢失去平衡、麻痹、虚脱等症状时，可剖杀取脑，作印片，检查包涵体，如为阳性，即可诊断为狂犬病。动物试验虽然准确，但需要较多的动物和较长时间。为了确诊，在病毒鉴定时，可使用标准免疫血清作中和试验。（三）荧光抗体检查近来多用此法。因为该法特异性强，简单而迅速，并且在包涵体尚未形成时，就可检查出抗原，因此，是诊断狂犬病较好的方法。此外，中和试验、补体结合试验、交叉保护试验、血凝抑制试验、间接免疫酶试验（HRP-SPA）、以及单克隆抗体检测、RT-PCR检测（比标准化荧光抗体法敏感100～1000倍）等均可用于狂犬病的检查。七、免疫与治疗狂犬病的预防和治疗常用疫苗（弱毒苗和灭活苗）及免疫血清，能得到良好的效果。对患狂犬病的病犬和可疑犬，应立即捕杀，以免伤害人、畜。伪狂犬病病毒伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus）又称猪疱疹病毒Ⅰ型，属于疱疹病毒科（Herpesviridae）疱疹病毒甲亚科（Alphaherpesvirinae）。它是引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种疱疹病毒。由于本病的临床症状同狂犬病有类似之处，曾被误认为狂犬病，后来才起用了“伪狂犬病”这一病名。本病广泛分布于世界各地。一、生物学特性本病毒呈圆形或椭圆形，为双股DNA，20面体立体对称，位于核心无囊膜的病毒粒子直径约110～150nm，位于胞浆内带囊膜的成熟病毒粒子的直径约180nm。衣壳壳粒的长度约12nm、宽9nm，其空心部分的直径约4nm.二、抵抗力本病毒是疱疹病毒中抵抗力比较强的一种，在畜舍内干草上的病毒，夏季存活30d，冬季达46d。病毒在pH4～9之间保持稳定。在50％甘油盐水中保存的病料0～6℃下154d感染力仅轻度下降，保存到3年时仍具感染力。五、致病性本病毒可感染多种家畜、禽类及野生动物，引起发热，剧烈发痒和急性脑脊髓炎症状。本病毒对小猪危害最严重，成年猪症状轻微，死亡很少，并常成为隐性带毒者。猪不发生瘙痒，但母猪流产，产仔减少。不足15d的仔猪，通常在出现症状后12～24h内死亡。本病造成的损失与年龄成负相关性，成年猪很少死亡，而仔猪的死亡率可达到100％。牛患病后在皮肤的某部位出现狂痒是本病的基本特征。狗和猫的症状与牛相似，但不攻击人和其他动物，常在出现症状后24～36h死亡。山羊无瘙痒症状，主要表现不安、大量出汗、后期出现痉挛和麻痹。多在24～48h内死亡。人可能具有某种程度的易感性。六、微生物学诊断（一）病毒分离在病的急性期，用棉拭子在口咽部取样。病死动物取扁桃体、颈淋巴结和鼻粘膜。收集局部水肿液和该区域的神经干。部分采集脊髓和脑（最好是中脑、脑桥和延脑）。1．鸡胚接种本病毒可适应鸡胚，接种4d后，在绒毛尿囊膜上可见白色痘斑性病变，并迅速侵袭整个神经系统，导致胚胎头盖骨突起。2．动物接种病料皮下接种兔，能产生典型的瘙痒症状，2d后兔舐接种部位，以后更狂暴，啃咬皮肤。症状持续4～6h，兔卧地不起，阵发性痉挛和呼吸困难死亡。经兔接种后的材料则可感染豚鼠和小白鼠，引起瘙痒症状。3．细胞培养猪肾传代细胞系（如PK-15）以及猪、兔和牛的原代肾细胞培养最适于病毒的分离培养。将待检的脑组织或扁桃体研磨成浆，用Hanks液或PBS液稀释成10％悬液，经2000r／min离心10min，取上清，接种长成单层的细胞培养液内，37℃吸附1h，加维持液继续培养。病变出现时间与样品中病毒含量多少有关，最早可在接种后18h出现细胞病变，晚的则在96h以后，一般在接种后48h。此时，将细胞培养物作苏木紫—伊红染色，镜检可见嗜酸性核内包涵体。据报道，兔肾细胞培养对本病毒特别易感，高于鸡胚和实验动物。（二）血清学检查1．血清中和试验一般用乳兔肾细胞或PK-15细胞。病毒滴度不低于105TCID50／0.1ml，使用滴度在100～500TCID50范围内。被检血清作倍比稀释。血清中和效价在1:2时可疑，1:4时为阳性。2．ELISA试验某些国家已把ELISA（间接法）作为诊断该病的标准方法。但该病毒的抗体与牛疱疹病毒Ⅰ型抗体有交叉反应。在同等条件下，用已接种病毒和空白细胞培养物分别制备病毒抗原和对照细胞抗原。如被检血清在病毒抗原孔的吸收值较对照孔高0.15以上者判为阳性。3．荧光抗体试验采取新鲜病料，做冰冻切片进行荧光抗体染色（间接法）检查，该法比病毒分离更快速。4．琼脂扩散试验抗原用PK-15细胞系生产制备，待检猪血清不稀释，25℃左右14～18h即可判定。但该方法尚需在实践中进一步验证。七、免疫与治疗本病尚无有效药物治疗，紧急情况下用高免血清治疗，可降低死亡率。目前针对该病的弱毒苗、弱毒灭活苗、野毒灭活苗及基因缺失苗已研制成功，在许多流行地区应用，能有效减缓猪感染后的临床症状，大大降低本病的发生，减少经济损失。但靠疫苗接种不能消灭本病，一般无本病猪场禁用疫苗。还有研究证明，当猪同时接种两种不同的基因缺失疫苗后，病毒会发生基因重组现象，因此在同一个动物体中只准使用一种基因缺失苗，以避免疫苗毒株间的重组。猪瘟病毒猪瘟病毒(Hogcholeravirus，HCV)属于黄病毒科的瘟病毒属,是猪瘟的病原体，可以引起各种年龄的猪只发病。病的特征为急性、热性、高度接触性的传染病。该病毒感染后发病率极高，死亡率也很高，有时高达80～100%，对养猪业造成极为严重的危害。一、生物学特性猪瘟病毒是单股RNA病毒,相对分子量为4×106道尔顿。本病毒呈圆形颗粒状，其直径为38～44nm，核衣壳为对称的20面体立体结构。二、抵抗力猪瘟病毒是动物病毒中对外界环境抵抗力较强的一种。血液中的病毒在37℃存活7d，50℃存活3d，60℃加热16～24h、72～76℃加热1h杀死该病毒。存在于尿中的病毒，用2%氢氧化钠作用15min死亡。存在于血液中的病毒，用2%氢氧化钠需1h死亡，2.5%的甲醛1h杀死病毒，0.5%石炭酸杀死血中的病毒需用60多天。低温有利于保存病毒，-5～-12℃可生存3个月，在冷冻猪肉内存活6个月，-70℃下可存活数年。病毒在腐败的尸体中能存活3～4d，在骨髓内存活15d。在熏火腿中存活1～2周，薰肉中存活4周，腌渍猪肉中存活5周，盐渍猪肉中存活12周。五、致病性本病毒只感染猪，各种年龄、性别及品种的猪均易感染，野猪也可以感染。猪瘟病毒人工接种于家兔、豚鼠、小鼠、绵羊、山羊、牛、马、猫均不发生明显的感染症状。但当静脉接种家兔后，再通过猪体，反复数代后，病毒可适应于兔体；再通过兔体多次传代后，可引起兔的体温升高，失去对猪的致病力，而得到一个毒力变异的毒株，即猪瘟兔化弱毒株。应用这个弱毒株制成兔化弱毒疫苗。这个疫苗在全国大量推广应用，在预防猪瘟病上收到了极显著的效果，有力的控制了本病的流行。这个弱毒株也可以在绵羊、牛、马等动物体内繁殖，同时也可在猪肾单层细胞上生长繁殖，用来生产疫苗。六、微生物学诊断猪瘟的诊断根据临床症状及病理剖检变化就可以确诊。但是对非典型的猪瘟就要应用微生物学检验方法。常用的有以下几种试验。(一)兔体交叉免疫试验取6只健康、体温正常的家兔，分成两组，每组3只。一组为对照组，一组为试验组。试验组接种1:10倍稀释的乳剂，经7~14d后，试验组和对照组均接种猪瘟兔化弱毒疫苗，测温2次/d，连续观察3d，如试验组不出现体温反应，即可确诊被检材料有猪瘟病毒。(二)病毒分离采取发病早期病毒血症而高热的扁桃体、淋巴结、脾放在组织研磨器内研碎，加入10%水解乳蛋白Hanks液，制成1:10倍稀释组织悬液。以2000~3000r／min离心20min，吸取上清液，加入青霉素1000IU/ml、链霉素500g/ml，置4℃冰箱内过夜。第2d取出接种于猪睾丸单层细胞，37℃培养2~4d，然后接种100PFU的鸡新城疫病毒，再培养2~3d，根据细胞病变的出现与否来判断猪瘟病毒的增殖。用这个方法可分离出自然感染病毒。但对兔化毒株感染动物，病毒则不产生鸡新城疫病毒滴度。病毒分离出以后，应用此病毒为抗原，与已知猪瘟病毒免疫血清作补体结合试验、中和试验或用分离病毒制备抗原与标准猪瘟病毒免疫血清作间接酶标记免疫试验，均可对病毒进行鉴定。除此以外，还可以应用免疫荧光抗体试验、酶标免疫试验、直接蚀斑形成试验等方法进行诊断。七、免疫与治疗主要是采用猪瘟兔化弱毒疫苗和灭活疫苗进行主动免疫。可应用高免血清进行被动免疫和治疗，但价格昂贵，有效期短。禽流行性感冒病毒本病1878年首先发现于意大利，以后欧、美、非、亚洲的许多国家相继发生，直至1955年才弄清楚病原为A型流感病毒。1994年我国广东省某些鸡场发生一种以产蛋下降、呼吸困难等为主要特征的传染病，经病毒分离鉴定为H9N3毒株，确定了该病在我国的存在（自1959年以来从鸡中分离到AIV见表10-1）。禽流感的爆发流行给养禽业造成很大的经济损失。禽流感已经被国际兽疫局(OIE)定为Ａ类传染病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。一、生物学特性禽流感病毒属于正粘病毒科、流感病毒属。典型病毒粒子呈球形，也有的呈杆状或丝状，直径约80～120nm。含单股RNA，核衣壳呈螺旋对称。外有囊膜，囊膜表面有许多放射状排列的纤突（Spikes），纤突分两类，一类是棒状，由血凝素（HA）分子的三聚体构成；另一类是蘑菇状，由神经氨酸酶（NA）分子的四聚体构成，两种结构在囊膜上的比例约为HA：NA＝75：20。A型流感病毒的基因组是由分子量不同的8个片段所组成，每个片段分别转录和复制不同的蛋白质，8个片段编码的蛋白质分别为PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS210种。亚型毒株混合感染时，易发生基因的交换和重组，这是流感病毒发生变异的基础。禽流感病毒能凝集多种动物的红细