第十六章 转基因技术与作物育种(二)

基因工程是生物技术的核心技术，是最具生命力和最引人注目的前沿学科之一。第十六章转基因技术与作物育种四、受体细胞(receptorcell)(一)定义受体细胞又称宿主细胞(hostcell)，指能摄取外源DNA(基因)并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。(二)种类*原核生物受体细胞*植物受体细胞*动物受体细胞(三)受体细胞选择的基本原则*便于重组DNA分子导入和筛选克隆子。*能使重组DNA分子稳定存在于细胞内。*适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累，对于真核目的基因的高效表达，应具有较好的翻译后加工机制。*遗传稳定性高，对遗传密码的应用上无明显偏倚性。*易于扩大培养或发酵生长，具有较高的生产应用和理论研究价值。*安全性高，无致病性，不会对环境造成污染。容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，用作cDNA文库和基因组文库的受体菌。大肠杆菌蓝藻农杆菌(四)原核生物受体细胞酵母(五)酵母受体细胞酵母菌是最简单的真核单细胞生物；是外源真核基因最理想的表达体系。一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。(六)植物受体细胞常采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞。体细胞可表达基因产物，并且通过体细胞培养出了多种克隆动物。体细胞不易再分化成个体，(七)动物受体细胞第三基因工程技术路线•DNA片段的取得(目的基因的分离和制备)•DNA片段和载体的连接——重组体DNA•外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库•筛选与鉴定克隆子(含目的基因)•目的基因表达√√？一、重组体DNA导入受体细胞受体:原核生物细胞、真核生物细胞原核生物细胞：大肠杆菌真核生物细胞：酵母导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。1、重组DNA分子导入原核生物细胞感受态细胞携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。(1)转化(transformation)质粒为载体(2)转导(transduction)通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。含目的基因的DNA与噬菌体(病毒)载体的重组DNA分子导入受体细胞前，必须进行体外包装。将被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌、含广泛宿主辅助质粒的辅菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内。(3)三亲本杂交(triparentalmating)由于真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。2、重组DNA分子导入真核生物细胞(1)重组DNA分子导入植物细胞Ti质粒载体与含目的基因的DNA片段重组，导入根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。1)根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化将植物材料的叶片进行表面灭菌，用无菌的打孔器从叶片上取下圆形小片，接种含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌。由圆形小片长出的愈伤组织通过筛选培养和再分化培养就可以获得转基因植株。叶盘转化取含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌，同刚再生细胞壁的植物原生质体进行短暂的共培养，使重组DNA导入细胞，经筛选和再分化培养获得转基因植株。原生质体共培养转化此方法类似原生质体共培养转化法，不同的是首先建立植物悬浮细胞系。悬浮细胞共培养转化根癌农杆菌介导法一般用于双子叶植物。将含目的基因的外源DNA同金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。金属微粒在外力作用，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，植物细胞仍能维持正常的生命活动。2)微弹轰击(bombardment)基因枪(genegun)法将重组DNA涂于授粉的柱头上，或微量注射器将DNA注入子房，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠的卵、合子和心进人胚囊，转化尚不具有正常细胞壁早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。3)花粉管通道法聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。4)多聚物介导法多聚物同二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。5)电穿孔法在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。6)激光微束穿孔利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上；(2)重组DNA分子导入哺乳动物细胞1)病毒颗粒转导病毒DNA或RNA构建载体的转导过程主要有三种类型带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞；带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，但是被感染的受体细胞的基因组中已整合了病毒缺失的基因。动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀2)化学处理二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-dextran)磷酸钙二甲基亚砜促进哺乳动物细胞捕获外源DNA分子使细胞表面增加对外源DNA的吸附能力，增加膜的通透性由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导入受体细胞。3)脂质体介导(liposome)处于细胞周围的DNA随微针穿刺形成的小孔进入细胞，或随穿刺的针头带入细胞。显微注射法把外源DNA分子直接注入细胞4)显微注射“穿刺”原理和操作过程类似植物细胞的电穿孔转移5)电穿孔二、克隆子的筛选克隆子摄取外源DNA并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞。转化子采用转化方法获得的克隆子。重组子真正含有重组DNA分子的转化子。ampr(抗氨苄青霉素)、cmpr(抗氯霉素)、kanr(抗卡那霉素)、tetr(抗四环素)和strr(抗链霉素)等。1、根据载体选择标记基因筛选转化子抗菌素抗性基因和lacZ′基因目前常用的选择标记基因(1)抗菌素抗性基因和相应的选择药物筛选抗性基因把含目的基因的DNA片段插入其中之一选择标记基因区，导致该基因的插入失活。双抗选择标记载体epsps基因(2)载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选抗草甘膦具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(Z)、透性酶(Y)和乙酰基转移酶(A)。当培养基中含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。(3)乳糖操纵子lacZ'基因筛选含乳糖操纵子缺陷型(lacZ')的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。当含目的基因的DNA片段插入lacZ'基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。由于互补菌株本身长成白色菌落的干扰，在构建载体时再组装一种供抗药性筛选的基因(ampr等)。(5)核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选(4)生长调节剂非依赖型筛选定义：其编码产物能够被快速地检测，用来判断外源DNA是否已导入到受体细胞并检测其表达活性的一类特殊的基因。1.表达产物及其功能在未转化的细胞内不存在2、利用报告基因筛选转化子报告基因(reportergene)报告基因必须具有两大特点2.便于检测通常在含目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。gus染色的棉花胚状体常用的报告基因*gus(β-葡萄糖酸酶)基因gus基因产物能够分解4-甲基伞形花酮-β-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮转基因烟草来自荧火虫的荧光素酶*luc(荧光素酶)基因荧光素+ATP腺苷酸荧光素酰化复合物LUC氧化脱羧氧化荧光素*gfp(绿色荧光蛋白)基因绿色荧光蛋白395nm荧光蛋白3、根据噬菌斑筛选重组DNA分子(目的基因+载体)必须达到野生型λDNA的75%~105%才能够进行体外包装。1、根据重组DNA分子大小鉴定(一)、根据重组DNA分子特征鉴定从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测。三、重组子的鉴定从克隆子提取DNA，用合适的限制性内切酶切，经凝胶电泳检测，若酶切片段数量和大小同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致。2、限制性内切酶分析根据含目的基因两端已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。3、PCR分析优点：灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因杂交方法：斑点杂交、噬菌斑杂交4、分子杂交法DNA杂交P48：两个不同来源的单链DNA分子的核苷酸互补时，在复性条件可形成双链DNA。和DNA印迹(southernblotting)DNA杂交探针P48：指带有某种标记物的特异性核苷酸序列，能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交，并可根据标记物的性质进行有效的检测。杂交探针种类：32P、生物素、地高辛或荧光素提取待鉴定的转化子的总DNA，直接点样在分子杂交的膜上，用含目的基因DNA互补片段的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子。(1)斑点杂交法菌落或噬菌斑直接转移到用于分子杂交的膜上，先经溶菌和变性处理后，再用探针进行杂交。(2)菌落杂交或噬菌斑杂交DNA分子限制片段与放射性标记DNA探针杂交带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上放射自显影用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜(3)southern杂交(southernblotting)提取总DNA，经限制性内切酶切割，再用凝胶电泳、变性，转移到杂交膜上，用探针与其杂交。5、应用DNA芯片鉴定提取DNA或RNA并用荧光标记与芯片杂交以上方法可断定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列。6、根据DNA核苷序列鉴定(二)、根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定在一定条件下，RNA可以同转录该RNA的模板DNA链进行杂交RNA印迹(northernblotting)制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。基因的最终表达产物是蛋白质(酶)，因此检测蛋白质的一些方法可用于检测目的基因的表达产物。(三)、根据目的基因翻译产物的鉴定1、蛋白质凝胶电泳鉴定重组子由于含外源基因，其表达产物中增加了外源基因表达的多肽(蛋白质)2、免疫检测鉴定以细胞内表达的蛋白为抗原，用对应的特异性抗体进行鉴定。酶联免疫吸附(ELISA)enzyme-linkedimmunosorbentassay固－液、抗原－抗体体系，通过酶反应检测抗体与抗原的结合基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域。具有生长激素的转基因鼠第四节基因工程的应用第三转基因作物的生物安全性直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论。反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁灭了这个科学家的怪物。那么，人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己，还是拯救自己呢？对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士