DNA条形码技术

DNABarcoding在药用植物鉴定中的应用DNABarcodingintheidentificationofmedicinalplants刘滨李宏富DNA条形码技术(DNAbarcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNAbarcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNABarcoding的概念由加拿大动物学家PaulHebert首次提出。PaulHebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（CytochromecoxdaseI，COI）基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNAbarcodes）并提出为全球生物编码的计划。DNA条形码的原理DNA是生物的遗传信息载体。遗传基础的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础，每个位点上都有A、T、G、C4种选择。由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。DNA条形码的标准Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA条形码标准：(1)具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；(2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；(3)片段足够短，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增。DNA条形码的优点生命条形码联盟(consortiumforthebarcodeoflife,CBOL)阐述了DNA条形码的优点：(1)以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。(2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。DNA条形码的优点(3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差(4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。操作及分析方法1.提取目的基因2.PCR3.电泳4.结果分析植物DNA的提取1.2g新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好；2.至50ml离心管中，加8ml细胞提取液，混匀，65℃水浴保温20min；3.取出离心管，加入2.5ml5mol/LKCl溶液，混匀，冰浴20min；4.4000r/min×20min，并转移上清至另一50ml离心管；5.加等体积酚/氯仿混匀，12000r/min×5min，取上清；6.加等体积氯仿，混匀，12000r/min×5min，取上清；7.加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀8.离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。干燥沉淀（不要太干，否则DNA不易溶解）。9.加入200μLTE缓冲液，溶解DNA；10.上清液就是所需的目的基因DNA。参考：《分子生物学实验指导》（第二版）高等教育出版社主编：魏群聚合酶链式反应（PCR）1.PCR技术的创建2.PCR的原理3.PCR的反应体系和方法4.PCR技术的近现代运用基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环TaqDNA聚合酶的发现，使整个PCR过程更加的简单化，让整个反应省事、省力、省财。不用在关键环节（变性-褪火-延伸重复）不断的加入反应底物。PCR技术的原理1PCR技术的基本原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计原则：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶1反应体系PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性使双链DNA解链为单链94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever全新4通道实时荧光定量PCR仪•普通梯度PCR仪PCR技术的应用1)基因克隆重组DNA质粒DNA基因片段大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因基因工程产品5’5’BamHIBamHIBamHIBamHIGTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG质粒DNA目的基因限制性核酸内切酶2)基因检测A’内源性病变基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)遗传病的诊断基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成不平衡A正常人病人正常病人ASO探针法ACTGASO探针正常病人PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子PCR-RFLP法：限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶正常突变电泳HLA系统基因分型PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP3)基因配型PCR-SSP12345678PCR12345678引物特异性（序列特异性引物-PCR技术）4）基因鉴定女性男性Y引物PCR男性女性法医学分析个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLPDNA遗传指纹PCR-ASOPCR-VNTR多态性PCR-SSCP线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCR；电泳检测（VNTR：数目可变的串联重复序列）琼脂糖凝胶电泳1.操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；2.凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附微笑，因此图谱清晰，分辨率高，重复性好；3.琼脂糖凝