十五、艾滋病抗病毒治疗的耐药检测方法

HIV-1耐药及耐药检测中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所张旻HIV病毒模式图HIV病毒颗粒由基因组RNA、外膜蛋白Env、衣壳蛋白Gag、逆转录酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN组成HIV生活周期吸附－穿入－脱壳－生物合成－组装成熟和释放HIV基因组模式图我国及国际两种不同抗HIV治疗方案效果比较治疗方案国内治疗病毒抑制效果国际治疗病毒抑制效果平均治疗时间(月)载量LDL例数总例数病毒抑制率(%)AZT+ddI+NVP7.5197027.1%a45%d4T+ddI+NVP3.910613876.8%b85%注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不同表示组间差异显著项目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期两年，2005年7月-2007年6月．全球基金将根据第一期执行情况确定后三年的投入。项目实施地区：广西、贵州、湖南、江西、四川、新疆、云南７个省（自治区），35个地(州、市），76个项目县（市、区）。178云南63江西95湖南105贵州7635合计115新疆104四川135广西县（市、区）地(州、市)项目省总经费预算：五年总经费为9807万美元,其中全球基金支持约6374万美元,中国政府配套约3433万美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。两年经费预算：二年预算约为3100万美元,其中全球基金支持约2400万美元,中国政府配套约700万美元.。全球基金支持经费配套经费项目总经费广西3,605,6091,060,6364,666,245贵州2,365,191697,4453,062,636湖南2,487,791724,4503,212,241江西1,735,176506,2112,241,387四川2,623,645771,1363,394,781新疆3,137,663922,7394,060,402云南4,470,6641,310,9545,781,618中央3,511,1781,002,3204,513,498合计23,936,9176,995,89130,932,808目标六：建立服务网络，确保针对艾滋病病人/感染者开展的治疗、关怀和支持等活动的开展，包括母婴阻断。活动：在项目省建立和运转耐药监测实验室,开展耐药监测工作,帮助扩展和改进国家耐药监测网络各省省级建立实验室定为哨点的项目县按方案采集血样需要了解的主题:•什么是耐药性?•药物的作用靶点与机制?•与病毒的哪些基因有关?•耐药性是怎么产生的?•那些因素促使耐药性病毒株出现?•耐药性分类与耐药机制。•如何检测耐药株?•检测中注意事项。什么是HIV耐药性?HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作用，使药物敏感性降低或不敏感的现象。什么是HIV耐药性?药物浓度病毒抑制率(%)野生型病毒耐药株1000IC50,WTIC50,MT50耐药倍数IC50=50%抑制浓度药物的作用靶点与机制?药物的作用靶点与机制：全国艾滋病定点医院检测技术研讨班AntiretroviralDrugs2004NRTIsNNRTIsPIsZidovudineNevirapine*SaquinavirDidanosineDelavirdineRitonavirStavudineEfavirenz*IndinavirLamivudine*Nelfinavir*ZalcitabineAmprenavirAbacavirLopinavir/rCombivirAtazanavirTrizivirFosamprenavirDidanosineECStavudineSRFTCNucleotideRTITenofovirEntryInhibitorsT20药物的作用靶点与机制：药物作用机制核苷类逆转录酶抑制剂被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从而参与病毒DNA的合成，由于该抑制剂经过化学修饰，将导致病毒DNA链合成终止。非核苷类逆转录酶抑制剂是一组结构多样化的化合物，通过非竞争性的方式结合于或者接近于病毒逆转录酶的活性位点，从而抑制病毒逆转录酶的活性。蛋白酶抑制剂肽类似物，通过接合于病毒蛋白酶的活性位点来抑制酶的活性，使之不能将病毒合成的多聚前体蛋白水解为病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分。耐药性是怎么产生的?•病毒自身因素—内因•药物的选择压力—外因耐药性是怎么产生的?•病毒自身因素—内因—HIV-l的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。—在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随时发生。•每个复制周期产生一个突变点；•每天产生109–1010个新病毒；•病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次耐药性是怎么产生的?•药物的选择压力—外因—在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快能发生在14至28天内。“Wild”typevirus(drugsusceptible)“Mutant”virus(drugresistant)DrugPressureTIMEViralDynamicsandDrugResistanceViralLoad&ReplicationRateViralLoad&ReplicationRateTIMELowReplicationRate&ViralLoadLess“fit”virusPressure:DrugAPressure:DrugBPressure:DrugC,....(Combined)UseofActiveAntiretroviralAgents耐药性是怎么产生的?—耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。那些因素促使耐药性病毒株出现?病毒载量耐药株出现时间300,0000.130,00013,00010300100301,0001.那些因素促使耐药性病毒株出现?病毒学失败率(%)0204060801009590-9580-9070-8070服药依从性(%)82.171.466.754.621.72.那些因素促使耐药性病毒株出现?服药依从性(%)2.那些因素促使耐药性病毒株出现?药物配伍不当—药代显著不同药物配伍3.024483612时间(小时)药物浓度潜在病毒复制区IC90IC50最后一次用药第一天第二天单药治疗S.Tayloretal.11thCROIAbs131那些因素促使耐药性病毒株出现?—细胞周期依赖性药物AZT,D4T(活化期细胞)DDI(静止相细胞)蛋白酶抑制剂(活化期细胞)—非细胞周期依赖性药物3TC,FTC,AbacavirTenofovirNNRTIs3.药物配伍不当—缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足那些因素促使耐药性病毒株出现?—胃肠道吸收不好：呕吐，腹泻；—随意间歇服药；—与中药或其他药物同时服用。4.其他因素什么是好治疗方案?—能快速抑制病毒；—不易产生耐药性；—可长期维持；耐药性分类1、原发性耐药(Primaryresistance):病人在接受抗病毒治疗前产生了药物作用靶点的变异，或者感染了耐药毒株，均降低抗病毒药物的敏感性。在已经开展HAART的国家普遍存在，感染了耐药毒株的病人很容易引起药物治疗失败。2、继发性耐药(Secondaryresistance):病人已经接受了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药物的选择压力下产生的耐药。耐药机制：核苷和核苷类似物1、破坏核苷类似物结合病毒DNA的能力M184V突变:RT酶第184位密码子的氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬氨酸(V)。拉米夫定(Lamivudine)Q151Mmutation:在HIV-1中出现低于5%；HIV-2中出现频率较高。耐药机制：2、切除病毒DNA链末端的核苷类似物Thymidineanaloguesmutations:突变引起ATP或者焦磷酸介导的切除DNA链3‘末端核苷类似物。核苷和核苷类似物耐药机制：非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就能导致高度耐药。如K103N、Y181C。耐药机制：K103N突变的机制耐药机制：蛋白酶抑制剂HIV蛋白酶由两个同样的蛋白质链组成。这两个蛋白质链在一起就如同核桃的两半，而蛋白酶的活性位点就在两个半壳的中间。突变点的表示方法：基因的突变通常以字母－数字－字母的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录酶（RT）K103N的突变表示逆转录酶第103位密码子的氨基酸由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。如何检测耐药株：目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，可在样品收集后1～2周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。如何检测耐药株：TranslationintolinearstringofaminoacidsFoldingintofunctionalproteinHIVRNA表型检测基因型检测基因型和表型检测检测中注意事项:—在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保证耐药株占总病毒量的20%以上；—病毒载量1000时,可出现假阴性。我国HIV耐药性本底抽样调查结果1)对于RT基因区共完成对21个省区共143个样本的测序，仅有2例发现具有轻微耐药（占总样本数的1.4%）2)对于蛋白酶基因区本次调查共完成20个省区168个样本的分析，仅发现有2例样本（占总样本数1.21%）具有轻微耐药。结论：当前我国HIV耐药性处于较低状态，对于几乎所有药物敏感，我国抗HIV药物的使用如果有计划的开展，应当会有较好的效果，但应加强治疗依从性促进工作和耐药毒株的监测工作。HIV基因型耐药性检测（序列测定法）检测流程病人血浆标本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列测定结果解释RNA提取逆转录PCR扩增特定的解释系统标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80℃保存，避免反复冻融病毒RNA提取（Qiagen公司试剂盒）裂解标本，灭活RNA酶加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合洗两次，去除杂质用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA收集RNA备用优点：操作简便、快速、得率高逆转录RNAcDNA反应体系：10XBuffer1ldNTP0.5l外侧反向引物1lRNaseinhibitor0.25lM-MuLVRT0.25lDEPC水2lRNA模板5l42℃水浴1小时，95℃5分钟灭活RT巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第一轮扩增反应体系：10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l外侧正向引物1l外侧反向引物1lTaq酶0.5l水29.5lcDNA模板10l94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因第二轮扩增反应体系：10XBuffer5lMgCl23ldNTP1l内侧正向引物1l内侧反向引物1lTaq酶0.5l水29.5l第一轮扩增产物10l94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃2.5min30循环扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳扩增产物纯化QIAquickGelextraction试剂盒核酸序列测定双脱氧链末端终止法:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAA