果蝇唾液腺染色体标本的制备与观察

果蝇唾液腺染色体的制备与观察微生物技术班潘红芳2011/10/11摘要：本论文以果蝇三龄幼虫为实验材料，通过解剖分离出其唾液腺，制备染色体标本，在显微镜下观察果蝇唾腺染色体的形态特征，寻找形态良好分散适中的图像仔细观察，并根据唾腺染色体上横纹的形态和排列，识别不同的染色体。我观察到5条染色体臂，它们从染色中心以V字形向外伸出，由于短小的第4染色体有时不易现察到，所以我只识别了5条染色体长臂。根据染色体臂末端横纹及形态特征，我识别出了两条臂，X及3R。前言：双翅目昆虫(摇蚊、果蝇等)幼虫期的唾腺细胞很大，其中的染色体称为唾腺染色体。这种染色体比普通染色体大得多，宽约5um，长约400um，相当于普通染色体的100—150倍，因而又称为巨大染色体。唾腺染色体处于体细胞染色体联会配对状态。并且唾腺染色体经过多次复制而并不分开，每条染色体大约有1000—4000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体。多线染色体经染色后，出现深浅不同、密疏各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特征；如染色体有缺失、重复、倒位．易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。各染色体的异染色质的着丝粒部分互相靠拢形成染色中心(chromocenter)；横纹有深浅、疏密的不同，各自对应排列，这意味着基因的排列。唾腺染色体广泛应用于细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学及分子遗传学的研究中。实验材料：仪器用具：显微镜，果蝇培养瓶，镊子，解剖针，毛笔，载玻片，盖玻片，吸水纸等药品试剂：生理盐水、盐酸、蒸馏水、改良苯酚品红染色液等培养基：玉米琼脂培养基实验材料：果蝇三龄幼虫实验方法：1.剥离唾腺：在一干净的载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫，或者选择经低温处理的果蝇三龄幼虫置于载玻片上。每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。由于果蝇的唾腺位于幼虫体前1/3-1/4处，所以左手持解剖针按压住虫体前端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺腺体随之而出。如图。2.解离：在唾腺组织上滴一滴1NHCl，解离1-2min，以松软组织，利于染色体的分散。3.吸去HCl，用水冲洗2-3次.4.染色：滴加改良苯酚品红染液染色10min,染色时间不可过长，否则背景也着色。5.压片：染色完成后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。将片子放在实验台上，用大拇指用力压住，并横向揉几次。（注意不要使盖片移动，用力和揉动是一个方向，不能来回揉。）6.镜检：先用低倍镜进行观察，找到分散好的染色体再转用高倍镜进行观察。实验结果及分析：图11如图1箭头所示，确定染色中心后，可以分辨出有5条长臂与染色中心相连。由于染色体展开不成功，且4染色体臂很短，故没有观察到4染色体。我共找到了四个染色体臂的末端，但根据唾液染色体各条臂末端的形态特征，只确定了两条臂的末端，分别是X，3R。2由图可见，X染色体臂末端有一个永久性的蓬突，虽然X染色体臂发生了弯折，但仍可辨别；虽然该染色体臂与2L臂末端有所相似，（2L臂是在末端尾处也可能存在颜色浅的蓬松），但是由课本67页图可确定，2L臂末端挨着末端蓬松处的臂有明显的横纹，颜色应该较深，但是图1中靠近蓬松处的染色体臂颜色较浅，故可判定为X臂，而不是2L臂。3之所以判定3R臂，主要是因为3R臂末端有几条横纹，如果染色时间过长的话，很可能将数条横纹染成一条较粗的“横纹带”，即如图中标定3R的臂的末端有一条很粗的颜色很深的“带”。4红色箭头所指处，不是染色体臂末端，应是染色体臂蓬松处受损断裂而成，故虽然该断裂处附近有一小型蓬突，也排除了它是2R染色体臂的可能。5另外两条臂末端无法辨别。染色中心3RX6此标本压片不成功，染色体臂没有完全展开，各染色体臂交缠在一起，无法清楚判定各臂。但尚能确定由染色中心伸出了5条长臂；断臂无法准确判断。再者，此标本染色时间过长，本该染色浅的部分着色也很深，无法清晰辨别横纹。图2此片制备较为成功，能清楚的观察到染色中心和5条长臂及1条断臂；但选择的幼虫为三龄前期或者是二龄幼虫，故染色体臂较细，不易观察横纹。我推测，由于处于三龄前期或二龄幼虫期，染色体复制后螺旋化程度尚低，或DNA复制尚未达到9次，故致使形成的染色体臂较细。实验小结：1一定要加生理盐水，否则唾液腺容易干，影响其正常形态，进而影响观察。但生理盐水不可加太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。如水多了，请再剥离唾腺前吸走些，唾腺剥离后请勿吸水，以防将唾腺一起吸走。2.清除脂肪组织时要量力而行；在实验中，我发现如果严格按照实验步骤所写剥离唾液腺，撕裂后唾液腺将与脂肪分离，得到较干净的唾液腺，很少脂肪干扰。我多次剥离，每次都很成功，几乎没有脂肪。如果脂肪真的很难去除，则可用解剖针截取一部分没有脂肪的唾液腺细胞，不必一定要完整的唾液腺。4.染色液勿过多，否则压片时唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色液已干，应再少加些染色液，再盖上盖波片，避免气泡产生。5.染色时间不要太长，否则背景会着色，影响观察效果。6.用吸水纸吸取液体时，一定要注意不要将唾液腺吸走。实验中，我缓缓倾斜载玻片，让载玻片上的液体慢慢流下，而唾液腺粘在载玻片上游，用吸水纸在下游轻轻吸取溶液。向唾液腺组织滴加染液或蒸馏水时，如果滴管口距离载玻片太近，滴下液体时，由于水的表面张力作用，唾液腺会被水带到滴管口上。我曾经两次将唾液腺细胞粘到滴管口上，后来总结出经验，将滴管口离载玻片稍远一些，不至于将唾液腺吸走，也不至于液滴滴下时将唾液腺溅走。7.我经过多次实验，发现压片前先轻敲，使染色体分散，压片时再朝一个方向揉片，这种方法效果比较理想。8.本次实验难度较大，但是孰能生巧；我操作了十次之后，终于比较熟练，掌握了制片的技巧，最终获得了较为理想的标本。染色中心