生化药物制备第二章基因工程制药

第二章、基因工程制药第一节、概述现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术。1982年，第一个基因重组产品—人胰岛素在美国问世。基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类：免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足。基因工程技术生产药品的优点：a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障；b.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；c.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；d.内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二节、基因工程药物生产的过程基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。噬菌体遗传学限制酶的发现质粒载体细菌抗药性遗传学噬菌体载体DNA合成与修复细菌基因调节研究外源DNA插入载体动物病毒学细菌表达载体构建基因文库哺乳动物表达载体大规模的蛋白合成克隆特定的基因制备探针反转录病毒和反转录酶mRNA结构与代谢的研究寡核苷酸合成蛋白序列分析小鼠胚胎学插入生殖细胞定点突变改变基因结构功能分析序列分析DNA序列分析RNA序列分析基因工程的诞生与及其相关学科的关系基因工程药物制药的主要程序⒈目的基因的克隆，⒉构建DNA重组体，⒊DNA重组体转入宿主菌，⒋构建工程菌，⒌工程菌发酵，⒍表达产物的分离纯化，⒎产品的检验等。基因工程药物的制备流程基因工程药物生产的基本过程基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。基因工程药物的上游技术：1、基因克隆载体:质粒载体，2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的载体DNA和待克隆的核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。三、目的基因的获得问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？目的基因的获取途径：1、逆转录法逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA克隆表达。（1）、mRNApurification（mRNA纯化）a.细胞内RNA的组成和含量:DNA:95%核内，5％细胞器RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%b.真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法。3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAOligo(dT)纤维素Poly(A)--Oligo(dT)100mMNaCl洗脱rRNA/tRNA10mMTris1mMEDTAPoly(A)mRNATotalRNA纤维素柱纯化Poly(A)mRNA流程图（2）、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。（3）、cDNA第二链的合成；反应在DNA聚合酶I催化下完成(4)、cDNAcloning；质粒DNA：expressionvectorpUC，pBR322噬菌体DNA:λgt11,λgt11等。基因工程基本过程：双重旋转对称的结构或称回文序列(palindrome)。(5)、将重组体导入hostcell(6)、cDNAlibraryidentification（cDNA文库的鉴定）(7)、目的cDNA克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。）2、反转录—聚合酶链反应法mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA链，用于重组、克隆。3、化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成基因的限制：a.不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。b.人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。c.费用太高。筛选基因的其他方法1编码序列富集法2岛屿获救PCR法*CpG岛CpG岛（CpGislands）是指DNA上一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。哺乳类基因中的启动子上，含有约40%的CpG岛（人类约70%）。一般CpG岛的长度约300到3000个碱基对（bp）。常用的正式定义是指一个至少含有200bp的区域，其中GC所佔比例超过50%，且CpG的观察值／预测值比例必须高於0.6。*持家基因(house-keepinggene)*Alu序列Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一员，约有50万份拷贝。也就是说平均4～6kb中就有一个Alu序列。由于这种DNA序列中有限制性内切核酸酶Alu工的识别序列AGCT，所以称为Alu重复序列。3动物杂交法4功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。5构建cDNA文库6差异显示技术第四节、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。1、宿主细胞的选择（1）、宿主细胞的基本要求：①容易获得较高浓度的细胞；②能利用易得廉价原料；③不致病、不产生内毒素；④发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑤容易进行代谢调控；⑥容易进行DNA技术操作；⑦产物的产量、产率高，且易提取纯化。宿主细胞的分类①原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。(1)、原核细胞a:大肠杆菌：表达产物的形式,细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。①、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。②、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusionbody)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。特点:③、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。b:枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。C:链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。(2)真核细胞a:酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。b:丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。*哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。2、大肠杆菌体系中的基因表达（1）表达载体真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：⑴载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。严谨型：1-3个拷贝松弛型：可达3000个⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。常用表达载体--质粒pBV220的结构pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；pBV220系统优点：SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列（5′…AGGAGG…3′），能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%；产物以包含体形式存在,不易降解,均一性好；pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。融合表达质粒pBG-2的结构(2)pET系统插入基因的转录和翻译系统来源于T7噬菌体。表达由位于宿主细胞染色体上的T7-RNA上宿主细胞染色体上的T7-RNA聚合酶控制，T7-RNA聚合酶启动子为lacUV5