长寿花组培快繁实验设计

潍坊市职业学院项目课程实验设计项目名称：植物的组培快繁实训地点：学院组培中心实验设计者：王珏（0903199）09级园林工程系生物技术及应用专业设计时间：2010年12月26日—2011年7月9日指导教师：丁雪珍一实验名称：长寿花的组培快繁二实验目的：1、通过对长寿花进行组培快繁从而进一步了解植物组培快繁的原理；2、熟悉并掌握植物组配快繁的工艺流程；3、更熟练的掌握组培快繁的多项技术；4、对植物的组织培养的方法及有关知识拥有更深的了解；三实验原理植物的组织培养是指在无菌条件下，将植物的离体器官、组织、细胞以及原生质体，应用人工培养基，创造适宜的培养条件，使其长成完整小植株的过程。植物的组织培养也就是根据植物细胞的全能性（每个具有完整细胞核的细胞都具有该植物的全部遗传信息和产生完整植物体的能力）利用外植体（从植物体上切取下的根、茎、叶、花、果实、种子、器官以及各种组织和细胞）进行了转接、继代培养以及驯化的过程，虽然此过程投资少、成本低而且历时短但是植物组织培养拥有很多优点。如：1、研究材料单一，无性系遗传信息相同；进而保证了遗传性状的一致性，避免了误差，实验材料的纯度高，可以减少实验的重复而不影响实验的精度。2、经济方便，效率高；进行实验时投资少、成本低但是利润高从而节约了人力和物力。3、培养条件了可控，可周年实验或生产；避免了由于节气带来的影响。4、生长快，周期短，重复性强；5、管理方便，利于自动化控制；通过仪器来提供试管苗的培养环境，大大节省了人力、物力及土地，也有利于工厂化生产。本次实训以植物花月为对象用其幼叶作外植体进行组织培养（无菌短枝型），来领悟植物组织培养的原理。四实验仪器及其他用具1、玻璃器具玻璃棒；烧杯；量筒；三角瓶；试剂瓶；胶头滴管；果酱瓶；酒精灯；漏斗；2、所需的实验仪器酒精灯；电子天平；磁力搅拌器；冰箱；超净工作台；接种器具消毒器；立式高压蒸汽灭菌锅；电炉；培养架；空调；3、实验药剂蒸馏水；葡萄糖；琼脂粉；MS母液（大量元素、微量元素、铁盐、维生素）；6-BA；2,4-D；IBA；IAAF；活性炭；95%酒精；氯化汞溶液；洗洁精；高锰酸钾；4、其他用具纱布；喷壶；搁置架；打火机；弯刀剪；麻线；牛皮纸；封口膜；剪刀；试管刷；洗耳球；引流器；PH试纸；周转箱；胶皮手套；秒表；废空箱子；马铃薯；刀；案板；铁架台；铝锅；麦麸；穴盘等五设计方案1、实验研究对象植物长寿花拉丁名：winterpotkalanchoe科属：景天科，蔷薇属别名：寿星花原产地：东非马达加斯加岛长寿花（KalanchoeblossfeldianacvtomThumb）别名寿星花、假川莲、圣诞伽1.1植物简介长寿花是一种多肉植物，由肥大、光亮的叶片形成的低矮株丛终年翠绿。春、夏、秋三季栽植于露地作镶边材料，12月至翌年4月开出鲜艳夺目的花朵。每一花枝上可多达数十朵花，花期长达4个多月，长寿花之名由此而来。长寿花是元旦和春节期间馈赠亲友和长辈的理想盆花。长寿花为多肉植物，性喜较暖和气温，生长适宜温度以白天不超过30度，晚间温度不低于18度为宜。温度太高，太低会影响其正常生长。长寿花以扦插繁殖为主，温度在20~25度最适合其发根。长寿花适合排水好的土壤，以泥炭为主加上蛭石、珍珠岩的人工培养土最佳。培养土的ph值最好为5.8~6.2。长寿花对于水的需求量较低，中午前浇水完毕，入夜之前叶片一定要保持干燥。短日照植物，处理后至少6周后才会开花。短日照处理时最少每天要有14小时黑夜。一般而言，每年10月1日至第二年3月1日为自然短日期。种在较大花盆中的，生长初期要给予长日照处理，让植物达到一定大小后能给予短日照处理，使其开花。要不然，植株可能会偏小。1.2生长习性长寿花原产非洲。喜温暖稍湿润和阳光充足环境。不耐寒，生长适温度为15～25℃，夏季高温超过30℃，则生长受阻，冬季室内温度需12～15℃。低于5℃，叶片发红，花期推迟。冬春开花期如室温超过24℃，会抑制开花，如温度在15℃左右，长寿花开花不断。长寿花耐干旱，对土壤要求不严，以肥沃的砂壤土为好。长寿花为短日照植物，对光周期反应比较敏感。生长发育好的植株，给予短日照（每天光照8～9小时）处理3～4周即可出现花蕾开花。1.3繁殖方法在5～6月或9～10月进行效果最好。选择稍成熟的肉质茎，剪取5～6厘米长，插于沙床中，浇水后用薄膜盖上，室温在15～20℃，插后15～18天生根，30天能盆栽。常用10厘米盆。如种苗不多时，可用叶片扦插。将健壮充实的叶片从叶柄处剪下，待切口稍干燥后斜插或平放沙床上，保持湿度，约10～15天，可从叶片基部生根，并长出新植株。1.4光照与温度长寿花为短日照植物，对光照要求不严，全日照、半日照和散射光照条件下均能生长良好。适宜生长温度15-25℃。夏季炎热时要注意通风、遮荫，避免强阳光直射。冬季入温室或放室内向阳处，温度保持10℃以上，最低温度不能低于5℃，温度低时叶片容易发红。生长发育良好的植株经过短日照处理（每天光照8—9小时，其余时间遮光处理，20-30天即可形成花蕾）。浇水与施肥长寿花为肉质植物，体内含水分多，比较耐干旱。生长期不可浇水过多，每2-3天浇1次水，盆土以湿润偏于为好。如果盆土过温，易引起根腐烂。浇水掌握“见干见湿、浇则浇透”的原则。冬季应减少浇水，停止施肥。生长期每月施1、2次富含磷的稀薄液肥，施肥在春、秋生长旺季和开花后进行。2、外植体的选择与处理1）选择长势、大小、颜色相近，饱满的6片嫩叶和6个带有芽体或顶芽的茎段。2）在进行外植体消毒灭菌的过程中所需的试剂有：两个果酱瓶两的无菌水；0.1%氯化汞溶液100mL；75%的酒精；3）所需的玻璃仪器为：两个果酱瓶；两个三角瓶（盛装试剂）；三个空三角瓶（盛装外植体）；一个空瓶子（用以盛废液）；3、外植体的启动培养分别利用0.5mg/L、1mg/L、2mg/L的MS+IBA和1mg/L、2mg/L、3mg/L的MS+6-BA固体培养基进行启动培养。所需的用品为：三角瓶12个；MS母液500ml；;4、继代增值培养分别利用0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L的MS+IBA和1mg/L、2mg/L、3mg/L的MS+6-BA固体培养基进行启动培养。所需的用品为：三角瓶12个；MS母液500ml；5、生根诱导分别配置200ml的1/2MS+IBA、1/2MS+0.1%-0.2%的活性炭和1/2MS+0.1%-0.2%的活性炭+IBA0.2mg/L固体培养基，在此过程中要用到葡萄糖12g；琼脂4.5g；三角瓶12个；1/2MS母液600ml；注：以上三个步骤总需三角瓶44个；果酱瓶3个；封口膜88张；麻线44条；其他实验用具看具体实训状况。在外植体启动培养、继代转接和生根诱导时每一个外植体对应一个固体培养基。6、幼苗的驯化移栽当试管苗长到3-4cm时，洗去幼苗根部的培养基后转移到基质中培养。我将选择麦麸为基质，以16X8规格的穴盘为栽培场所；在插入幼苗前用0.5%的高锰酸钾进行基质的灭菌。注：在外植体启动培养时继代转接以及生根诱导时将瓶苗置于温度为25度左右、湿度在70%-80%之间的环境下培养，并定时观察瓶苗的污染率以及成活率。在移栽瓶苗后定时观察幼苗的长势、基质中水分含量及幼苗的成活率。六、具体实施步骤组培快繁实施方案内容提要本方案是长寿花组培快繁设计的具体化，具体描述了外置体的预处理/表面灭菌/启动及增殖/生根/驯化的过程；此外了解到了组培快繁的操作流程/前景以及外界环境对植物生长的必要性。关键词长寿花；组培快繁；外植体1材料与方法1.1实验材料1.1.1玻璃器皿烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；移液管；酒精灯；废液缸；罐头瓶；试剂瓶；胶头滴管1.1.2实验仪器超净工作台；电子天平；卧室高压蒸汽灭菌器；接种器具消毒器1.1.3实验试剂大量元素；微量元素；铁盐；肌醇；维生素；蒸馏水；IBA；6-BA；活性炭等1.1.4其他器材镊子；纱布；吸耳球；封口膜；剪刀；麻线；pH试纸；牛皮纸；麻线；喷壶等1.1.4实验材料长寿花的叶片及茎段1.2方法与步骤1.2.1外植体的选择及预处理用剪刀从长势健壮的植物长寿花幼茎上剪取15片大小、颜色大致相同的幼叶及五个带有芽体或顶芽的茎段。然后将外置体放入一大烧杯中用洗洁精清洗干净，等待无菌操作。1.2.2外植体的表面灭菌及转接1.2.2.1灭菌前的准备1、无菌水准备：让两个洁净空的果酱瓶称装上自来水，盖好瓶盖后等待灭菌（121℃，30min）。2、三角瓶的洗涤与烘干：挑选出完好无损的三角瓶15个进行洗涤，晾干后备用。3、启动培养基的制备：配置500mlMS固体培养基→每40mL分装到小三角瓶内→往培养基内加放事先计算好的6-BA及IBA的用量→用封口膜、麻线给三角瓶封口包扎→灭菌（121℃，30min）4、灭菌器材的包扎：用牛皮纸将纱布、搁置架、三个空三角瓶包扎后以备灭菌（121℃，30min）。5、灭菌剂的配制：配制0.1%的氯化汞和75%的酒精溶液各100mL，然后用试剂瓶盛装。1.2.2.2灭菌将包扎好的培养基和灭菌器材利用立式高压蒸汽灭菌器进行灭菌（121℃，30min）。1.2.2.3超净工作台的准备：接通超净工作台的电源后打开紫外灯→30min后关掉紫外灯再打开风机约20min→随后用肥皂洗手→打开日光灯进行无菌操作，1.2.2.4无菌操作（即：外植体的表面灭菌）：把灭好菌的纱布、搁置架、镊子、培养基、空三角瓶及装有70%酒精的喷壶、配好的灭菌剂、酒精灯、打火机、记号笔、秒表、外植体放入一空的周转箱内，然后将周转箱摆放到超净工作台的一侧，另一侧放一空箱子用于盛放灭菌后的牛皮纸。准备就绪后开始操作：1、拆下纱布并用70%的酒精浸透，拆下的牛皮纸放于空箱子内然后用浸有酒精的纱布擦拭手和超净工作台的台面对其进行消毒。2、点燃酒精并将灯帽扣于酒精灯一旁（为一旦有火灾发生时便于及时盖死酒精灯）或者在台面的一侧放一块干抹布；然后在酒精灯火焰旁拆开灭过菌的镊子、搁置架等并把拆下的牛皮纸放到空箱内并用浸有酒精的纱布擦拭盛有灭菌剂的果酱瓶及培养基瓶、空三角瓶的瓶壁；最后有次序的摆放好台面上的物品进而进行无菌操作。3、用灭完菌的镊子将选好的外植体放于空三角瓶内，且每空三角瓶内装入的外植体数目为4-5个。4、先往三角瓶内倒入适量的0.1%氯化汞溶液，灭菌3min；倒掉灭菌剂后再用75%的酒精进行灭菌，计时60s;最后用无菌水洗涤三次，每次历时1min。清洗干净后等待转接。注：（每次灭菌时要一边振荡，为的是赶走气泡；一只手拿住外植体的三角瓶进行灭菌两一只手给镊子灭菌，即：在酒精灯火焰的外焰上进行灼烧。）1.2.2.5外植体的转接：拆下包扎培养基的麻线，接着用灭过菌的镊子将外植体转接到培养基内（每瓶培养基转接一个外植体）；转接后灭掉酒精灯再包扎培养基；包扎好培养基后用记号笔标记好时间、操作人的名字；最后整理好超净工作台的台面，接着用周转箱将其置于培养架上培养。注（在打开和包扎培养基时都要在酒精灯火焰处灼烧瓶颈，给其灭菌；在给镊子后待镊子的温度冷却后再进行转接，避免温度过高烫伤外植体。）1.2.2.6培养：将瓶苗置于18-21摄氏度的培养室内进行培养。2试验结果及分析2.1外植体的转接外置体转接情况配方MS+6-BAMS+IBA浓度1mg/L2mg/L3mg/L0.5mg/L1mg/L3mg/L接种部位叶片茎段叶片茎段叶片茎段叶片茎段叶片茎段叶片茎段接种数量111111111111第一次转接培养5天后大部分叶片及茎段呈褐色。呈红褐色的叶片及茎段分析：可能是由于进行外置体表面面灭菌时灭菌时间太长导致的。第二次转接培养时的状态如图所示：七、实验心得与体会从实验设计到真正实施方案，我从中学会了查阅资料及分析资料的方法，从而定制出长寿花的组培快繁的方案。此外亲身体会到了组培快繁技术的广泛性和严谨性；从第一次外置体转接培养失败试验中得知外置体处理方法的专一性（即：每一种植物的外置体进行表面灭菌的时间都是一定的）和培养条件的专一性。八、附录：1、MS培养基的配方成分物质浓度(mg/L)扩大倍数母液