1-质粒DNA的提取

质粒DNA的提取碱裂解法什么是质粒(plasmid)?细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。染色体DNA质粒DNA目的要求学习用碱裂解的方法从大肠杆菌中小量提取质粒DNA的方法和原理。实验原理质粒是存在于大多数细菌染色体以外的能独立复制的双链环状DNA分子，是携带外源基因进入受体细胞繁殖与表达的重要载体，经常需小量制备。碱裂解法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异来达到分离目的。质粒DNA的提取和纯化步骤收集细菌使菌体裂解分离出质粒进一步纯化1.溶液I（pH8.0,50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL，10mmol/L1EDTA)2.溶液II（pH12.6,1%SDS,0.2mol/LNaOH)3.溶液III（pH4.8,5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)4.苯酚/氯仿/异戊醇:25:24:15.无水乙醇6.70%乙醇7.TE液（pH8.0,10mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA,含20ug/mlRnaseA）操作步骤p163质粒DNA的小量制备（碱裂解法）过夜培养液1.5mL,8000RPM离心2min，收集菌体溶液I（葡萄糖、TE、EDTA)100uL重悬菌体溶液II（SDS、NaOH)200uL轻柔颠倒混匀溶液III（乙酸钾、冰乙酸)150uL,颠倒混匀,冰浴5min8000rpm离心5min、吸取上清液于新的EP管中，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇混合液8000rpm离心5min，上清液加入2-2.5倍体积无水乙醇，冰浴10min10000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入70%乙醇1mL10000rpm离心5min，弃上清，沉淀干燥得到的质粒DNA用TE液（含RnaseA）溶解，消化RNA即得不含RNA的质粒DNA，用于酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定。注意事项1.高速离心机使用相关注意事项；2.加入溶液I后要使菌体完全重悬；3.加入溶液II和溶液III后，温和上下颠倒混匀溶液，以防DNA断裂；4.注意分层的有机相和水相；思考题1.质粒DNA的纯化常用碱裂解法,其中EDTA、SDS、酚的作用分别是什么？2.核酸的纯化中，无水乙醇和70%的乙醇的作用分别是什么？EDTA的作用是:抑制Dnase的活性,降低细胞膜的稳定性SDS的作用是:溶解细胞膜和核膜,并使蛋白变性酚的作用是:变性沉淀蛋白,抑制DNase的活性氯仿的作用是:加速有机相和水相分层异戊醇的作用是：消除因蛋白质变性而产生的泡沫，从而稳定两相界面pH8.0的Tris溶液（TE）的作用是:保证抽提时DNA进入水相,pH8.0可防止DNA变性无水乙醇作用:(在有盐的条件下)沉淀核酸70%乙醇作用:去除共沉淀的盐实验报告要求实验报告按下列要求书写1.实验题目——当次实验2.实验原理——简明扼要，有针对性3.操作步骤——最好是流程或表格形式4.注意事项5.实验结果——图表、数据或现象6.结果分析——根据实验结果，结合理论分析、体会7.思考题