引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性

华南理工大学学报(自然科学版)第39卷第1期JournalofSouthChinaUniversityofTechnologyVol．39No．12011年1月(NaturalScienceEdition)January2011文章编号:1000-565X(2011)01-0053-05收稿日期:2010-05-26*基金项目:广东省国际科技合作计划项目(B15B207108b)作者简介:钟振声(1955-)，男，教授，主要从事有机精细化学品的合成、提取和分析研究．E-mail:[e-mail]引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性*钟振声樊丽妃黄继兵(华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640)摘要:采用气相色谱－质谱联用仪(GC/MS)对从澳大利亚引种的广西玉林市互叶白千层茶树油进行化学成分分析;测试了该种茶树油的理化常数，并将结果与ISO国际标准进行了比较;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌种，对该种茶树油的抑菌活性进行了研究，并用混合药剂法测得了该种茶树油对供试菌种的最小抑菌浓度;最后考察了培养基pH值、食盐和蔗糖对该种茶树油抑菌活性的影响．发现:非特征成分桉叶素的相对含量高达72.49%，而特征成分4-松油醇只有0.78%;该种茶树油的大多数理化常数均不在ISO国际标准规定的范围之内;该种茶树油对供试菌种的最小抑菌浓度均为4.00mL/L，显示其有很强的抑菌活性;在pH=5～10范围内，该种茶树油对供试菌种都有较强的抑制作用;一定用量的食盐及蔗糖与该种茶树油之间存在明显的协同抑菌作用．这些结果表明，该互叶白千层茶树极有可能发生了变种，但其抑菌活性得到了保持．关键词:茶树油;互叶白千层;成分分析;抑菌活性中图分类号:TH83;Q93doi:10．3969/j．issn．1000-565X．2011．01．010互叶白千层茶树原生长于澳大利亚新南威尔士州的北部沿海，其茶树油与世界各地的相比产量最大、质量最佳，目前世界各地多有引种，我国广西、广东、海南等地也有大规模的栽培，其中广西为主要产区［1］．文献报道［2］茶树精油具有广谱抗微生物、抑菌、环保、温和天然清香、无污染无腐蚀、渗透性和生物降解力强的性质．茶树油应用于个人护理品(头发护理、身体护理、洗脚液、肥皂、抗菌型洗手液、口气清新剂及口腔护理用品)、健康用品(急救乳液、杀菌剂、烧伤护理等)中，可起到消炎抑菌、止痛、止痒的作用，现已进入美国食品、药品监督局采购名单．国际上茶树油已广泛应用于医疗、化工等领域，而在中国，茶树油的应用市场还不成熟．我国对茶树油的认识时间较短，目前仅在日化行业有所使用．茶树油的应用作为一个新兴产业，具有良好的开发价值和发展潜力．加强茶树油的基础研究和应用研究，提高我国茶树油的质量，开发茶树油的新产品，具有十分重要的意义．国内外文献采用气相色谱－质谱联用仪(GC/MS)对茶树油的成分进行分析，发现其主要成分有4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯、1，8-桉叶素等，其主要抑菌活性成分是4-松油醇．居解语等［3］对不同茶树油样品进行了成分差异研究，发现主要是1，8-桉叶素、γ-松油烯、异松油烯和4-松油醇这几种成分含量有较大差异．文中对从澳大利亚引进、经过十年选种培育的广西玉林互叶白千层茶树油进行了化学成分分析及抑菌活性研究，以此来揭示互叶白千层茶树油异地引种后的化学成分及抑菌活性的变化．1实验部分1．1主要材料与仪器茶树油，广西玉林市玉州区互叶白千层(澳洲茶树)种植基地提供，茶树引种已十年．大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，取自广州工业微生物检测中心菌种库．无水乙醇、95%乙醇、蔗糖、氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯;琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨，均为生化试剂．QP2010型气相色谱－质谱联用仪，日本SHI-MADZU公司;SPX-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;XS-212型生物显微镜，南京江南永新光学有限公司;SW-CJ-1D型净化工作台，苏州净化设备有限公司;YX-280D型手提式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司;10mm×7.8mm×(6±0.1)mm型牛津杯，浙江省宁海健民医疗仪器厂．1．2实验方法1．2．1茶树油理化常数的测定相对密度依据GB/T11540—2008测定;折光指数依据GB/T14454.4—2008测定;旋光度依据GB/T14454.5—2008测定;闪点依据GB/T14454.6—2008测定;乙醇中溶解(混)度依据GB/T14455.3—2008测定．1．2．2茶树油的化学成分分析方法称取一定量茶树油，用正己烷配制成质量浓度约为5mg/mL的样品溶液．采用GC/MS对茶树油进行定性和定量分析［4］．气相色谱:色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25mm);样口温度为260℃;载气为高纯氦;柱流量为1.0mL/min;分流比为100∶1;进样量为1μL;程序升温起始温度为70℃，速率为2℃/min，终止温度为180℃．质谱:电离方式为EI;电子能量为70eV;接口温度为250℃;离子源温度为200℃;溶剂延迟2min;加速电压为1.00kV;扫描范围为45～500u．1．2．3抑菌活性和最小抑菌浓度的测定采用二倍稀释法，用5%(体积分数)的无菌吐温-80溶液将茶树油配成体积分数分别为20%、5%的茶树油溶液［5］．采用牛津杯法［6］测茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，以相同体积分数的溶剂做对比实验．用混合药剂法［7］测茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球的最小抑菌浓度(MIC)．在培养基凝固前加入一定量的茶树油，混合均匀，使培养基中含一定量的茶树油．待培养基凝固后，在培养基表面划线接种细菌，37℃培养24h后观察细菌生长情况．每一种添加量做3个平行实验，以5%的无菌吐温-80溶液作为对照组．完全无菌生长的茶树油的添加量即为最小抑菌浓度(MIC)．1．2．4茶树油抑菌活性的稳定性分析根据文献［8］，在固体培养基凝固前将pH值分别调到4、5、6、7、8、9、10、11，然后用比各菌的MIC低一个体积分数梯度的茶树油溶液进行抑菌实验，比较不同pH值下该茶树油溶液的抑菌活性，确定其pH值活性范围(方法同MIC测定)．实验中以相应添加量的吐温-80水溶液作对照．在固体培养基凝固前加入不同质量分数的蔗糖、食盐进行抑菌实验(与pH值影响实验条件相同)，研究蔗糖、食盐对互叶白千层茶树油抑菌活性的影响．以吐温-80水溶液作对照．2结果与分析2．1茶树油的理化常数采用国标方法测得的茶树油的相对密度、折光指数、旋光度、闪点及在乙醇中的溶解度如表1所示．将测得的理化常数与ISO国际标准［8］相比较，发现引种茶树油除了在乙醇中的溶解度符合该标准之外，其余几项常数均不在标准规定的范围之内．这是由于该标准是对4-松油醇型茶树油的规定，而受测茶树油的成分与常规的澳洲茶树油相比，已经有了较大的改变，从而使得其理化常数与国际标准不同，具体见下文的分析．2．2茶树油的化学成分用GC/MS对茶树油进行定量分析，通过图谱(见图1)解析及相关资料查询，将各成分列于表2中．表1广西玉林引种互叶白千层茶树油的理化常数Table1PhysicalandchemicalconstantsofteatreeoilfromMelaleucaalternifoliaplantedinYulin，Guangxi，China项目相对密度折光指数旋光度/(°)闪点/(°)溶解度1)引种茶树油0．91731．4630+2．8381mL茶树油全溶于0．4mL的乙醇中，溶液澄清ISO标准0．885～0．9061．4750～1．4820+5～+15561mL茶树油全溶于不大于2mL的乙醇中，溶液澄清1)20℃下，在85%(体积分数)乙醇中的溶解度．45华南理工大学学报(自然科学版)第39卷图1茶树油的总离子流色谱图Fig．1Totalionicchromatogramofteatreeoil表2茶树油化学成分分析结果Table2Resultsofchemicalcomponentsofteatreeoil峰号保留时间/min化合物名称结构式相对含量1)/%引种茶树油ISO标准［8］13．101α-侧柏烯0．10—23．243α-蒎烯3．961．0～6．033．559莰烯0．07—44．002桧烯0．06微量～3．554．128β-蒎烯1．29—64．352β-月桂烯1．85—74．743伪柠檬烯0．12—85．092α-松油烯0．075．0～13．095．326对伞花烃0．64—105．444苧烯8．570．5～1．5115．5421，8-桉叶素72．49微量～15．0126．357γ-松油烯0．2410．0～28．0137．311异松油烯0．081．5～5．01411．5064-松油醇0．7830．0～48．01512．300α-松油醇8．271．5～8．01625．711香树烯0．32微量～3．01726．969香树烯0．15微量～3．01828．943(+)-喇叭烯0．21—1)各峰面积占总峰面积的百分比．从表2中可知，1，8-桉叶素是广西玉林茶树油的主要成分，相对含量高达72.49%，属于桉型茶树油［7］．一般所说的澳洲茶树油属于4-松油醇型，国际标准ISO规定其4-松油醇的相对含量在30.0%～48.0%之间，1，8-桉叶素相对含量须小于15%［9］．广西玉林从澳大利亚引种的互叶白千层茶树通过十年精选培育，不断改良，其茶树油中的1，8-桉叶素相对含量大大增加，而特征成分4-松油醇、α-松油烯、γ-松油烯和异松油烯的相对含量分别降低到不足1%，这说明引种的澳洲茶树极有可能已经发生了变种．2．3茶树油的抑菌活性与最小抑菌浓度选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，研究不同体积分数茶树油的抑菌活性，抑菌圈直径测试结果见表3．由表3中可知，茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌活性，即使茶树油体积分数由100%下降到5%，其抑菌活性下降的幅度也不到50%．表3不同体积分数茶树油的抑菌效果1)Table3Antimicrobialeffectofteatreeoilwithdifferentvo-lumefractions茶树油体积分数/%抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌10024．9925．302018．3719．27512．8614．471)以吐温-80溶液为对照，其大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均为0mm．一般认为，茶树油的抑菌物质应该是4-松油醇等成分，所以ISO标准中规定4-松油醇的相对含量要高于30.0%．文中所研究的引种茶树油几乎不含4-松油醇，却仍具有强烈的抑菌作用，这说明该茶树油与原种澳大利亚互叶白千层茶树油存在差别，其中起抑菌作用的成分极有可能不是4-松油醇．引种茶树油具体的抑菌成分有待进一步研究．用混合药剂法测得的茶树油的最小抑菌浓度见表4．由表4可以看出，茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度相同，均为4.00mL/L，与抑菌圈直径的实验结果相吻合．2．4茶树油抑菌活性的稳定性通常，受测物的抑菌活性会受到pH值、无机盐含量等因素的影响．文中考察了在不同pH值、不同质量分数的食盐或蔗糖存在下茶树油抑菌活性的变化，并对其抑菌活性的稳定性进行评价．55第1期钟振声等:引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性表4茶树油的最小抑菌浓度测定结果1)Table4MeasuredMICsofteatreeoil20%茶树油体积/mL培养基体积/mL茶树油添加量2)/(mL·L－1)大肠杆菌生长情况金黄色葡萄球菌生长情况样品组对照组样品组对照组0．114．91．33++++++++++++0．214．82．67++++++++++0．314．74．00－+++－+++0．414．65．33－+++－+++0．514．56．67－+++－+++0．614．48．00－+++－+++1)“－”代表牛津杯周围无菌生长;“+”代表牛