4.第四章-抗菌药物敏感试验(下)[1]

（二）联合抑菌试验1.单药纸片搭桥法—定性试验两种含药纸片贴于含菌琼脂表面，药物联合对被检菌作用可出现不同的图形。根据图形解释结果。两种药物间距：3~4mm单药纸片搭桥法2.棋盘稀释法—定量试验（1）原理将甲乙两药的各种稀释度加以组合，组成联合药敏管。同时两种药物每一稀释度都有一只加单一药物的单独药敏管。根据单一药物对被检菌的MIC和联合药敏管中的抑菌情况，可精确测定两药在适当浓度比例下所产生的相互作用。（2）试验步骤1）确定单药的MIC2）确定联合药敏的药物稀释度每一稀释度浓度为联合药敏管内所需单药终浓度的2倍用MH液体培养基将甲乙两药稀释6~8个稀释度3）棋盘状排列无菌试管排列6排无菌试管，每排6支4）加甲、乙两药（分别从横、竖排加入）每管各1ml，横排和纵排的第一管为无药对照，第一排为单药对照管5）加待测菌液各管加入被检菌液0.01ml菌液终浓度：105CFU/ml32/032/0.532/132/232/432/816/016/0.516/116/216/416/88/08/0.58/18/28/48/84/04/0.54/14/24/44/82/02/0.52/12/22/42/80/00/0.50/10/20/40/8甲药稀释乙药稀释例：甲药MIC单独16mg/L乙药MIC单独4mg/L结果判读FIC：部分抑菌浓度指数甲药联合时MIC乙药联合时MICFIC=+甲药单独时MIC乙药单独时MICFIC0.5协同作用0.5~1.0相加作用1~2无关作用2拮抗作用------------++++--++++--++++--++++--32168420甲药浓度00.51248乙药FIC=8/16+4/4=1.5------+-----++----+++---++++--+++++-FIC=4/32+2/8=0.375FIC=8/32+1/8=0.37532168420甲药00.51248乙药第五章细菌的分类与命名第一节概述一、基本概念1.分类（1）人为分类法：以形态、生理生化特征为依据（2）系统分类法：以细菌大分子物质结构的同源程度分类2.命名3.鉴定二、分类等级细菌的分类层次界、门、纲、目、科、属、种1.种(species)是细菌分类的基本单位。生物学性状基本相同的细菌群体构成一个菌种；2.菌属：性状相近关系密切的若干菌种组成一个菌属（genus）3.亚种和型：同一菌种的各个细菌，虽性状基本相同，但在某些方面仍有一定差异，差异较明显的称亚种(subspecies,subsp.)，差异小的则为型(type)。血清型：依据抗原结构的差异噬菌体型：噬菌体的敏感性生物型：生化反应和生物学性状4.菌株：对不同来源的同一菌种的细菌称为该菌的不同菌株(strain)。标准菌株(standardstrain)或模式菌株(typestrain）：具有某种细菌典型特征的菌株。三、细菌的命名法拉丁双名法Escherichiacoli（E.coli）属名种名中文：大肠埃希菌种名属名第二节细菌的分类方法一、生物学特性分类法传统分类法、数值分类法二、遗传学分类法-系统分类法DNA碱基比例的测定DNA碱基比例指DNA分子中G、C所占的摩尔百分比值，反映细菌间DNA分子同源程度核酸分子杂交法rRNA寡核苷酸分析第三十五章细菌耐药性检测第一节抗菌药物种类及作用机制1.抗菌药物（antibacterialagents）指对病原菌具有抑制或杀灭作用、用于预防和治疗细菌性感染的药物，包括抗生素（antibiotics）和化学合成的药物。2.抗生素（antibioticagents）：微生物在其代谢过程中产生的能杀灭或抑制其它特异病原微生物的产物。抗生素分子量小，低浓度就能发挥其生物活性，有天然和人工半合成两类。抗菌药物的种类分类代表药物β-内酰胺类大环内酯类氨基糖苷类四环素类氯霉素类化学合成药物抗结核药物多肽类抗生素青霉素类、头孢霉素类等红霉素、螺旋霉素等链霉素、庆大霉素等四环素、多西环素等氯霉素、甲砜霉素等喹诺酮类（氟哌酸、环丙沙星）利福平、异烟肼多粘菌素类、万古霉素按化学结构和性质一、β-内酰胺类（β-lactam）化学结构中含有β-内酰胺环的抗生素。β-内酰胺抗生素分子侧链的组成形式多样，形成了抗菌谱不同、临床药理学特性各异的多种不同β-内酰胺抗生素。青霉素的母核♣青霉素（penicillin）类：青霉素G、甲氧西林、阿莫西林、替卡西林、派拉西林等♣头孢菌素（cephalosporin）类：一、二、三、四代♣头霉西类：如头孢西丁。♣单环类：如氨曲南。♣碳青霉素烯类：亚胺培南、美罗培南♣β-内酰胺酶抑制剂：如舒巴坦、克拉维酸β-内酰胺类药物种类作用机制与青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制肽聚糖合成中所需的转肽酶，阻止肽聚糖链的交叉连接，干扰细胞壁合成。繁殖期杀菌药肽聚糖合成过程中的关键步骤细胞浆内：合成N-乙酰胞壁酸-五肽细胞膜上：合成N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸-五肽-磷脂细胞膜外：完成肽聚糖的交叉连接肽聚糖合成过程中需要的酶（PBP）转糖基酶：催化β-1，4糖苷键形成转肽酶：使N-乙酰胞壁酸-五肽脱去末端的D-丙氨酸，与另一条肽链的肽桥（五肽交联桥）交联，形成三维网状结构羧肽酶：催化五肽末端D-丙氨酸水解内肽酶：催化水解已合成肽聚糖上的肽键细菌生存必需的是转肽酶和转糖基酶二、氨基糖苷类1.种类链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、丁胺卡那霉素等2.作用机制选择性地与核糖体30S小亚基结合，影响蛋白质合成的全过程。静止期杀菌药三、喹诺酮类1.种类吡哌酸、氟哌酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、罗美沙星、诺氟沙星等2.作用机制作用于细菌的DNA旋转酶，干扰DNA合成四、大环内酯类1.种类红霉素、罗红霉素、螺旋霉素、吉他霉素、麦迪霉素、阿齐霉素等2.作用机制与细菌核糖体50S亚基结合，抑制转肽作用，影响核蛋白位移，从而抑制蛋白质合成。五、磺胺类1.种类磺胺嘧啶、甲氧苄胺嘧啶、复方新诺明等2.作用机制影响核酸合成，抑制细菌生长繁殖六、其他抗生素1.四环素类种类：四环素、土霉素、多西环素（强力）作用机制：与细菌30S亚基结合，抑制蛋白质合成2.氯霉素类种类：氯霉素、甲砜霉素作用机制：与细菌50S亚基结合，抑制蛋白质合成3.硝基呋喃类种类：呋喃妥因、呋喃唑酮（痢特灵）作用机制：干扰细菌体内氧化还原酶系统4.硝基咪唑类种类：甲硝唑、替硝唑作用机制：阻断细菌DNA合成抗菌药物的作用机制抗菌药物的主要作用部位喹诺酮类林可霉素类氨基糖苷类酮康唑环丝氨酸利福平红霉素制霉菌素杆菌肽甲氧苄胺嘧啶四环素类两性霉素B万古霉素磺胺药氯霉素多粘菌素类β-内酰胺类抑制核酸合成核糖体细胞膜细胞壁第二节细菌的耐药性和产生机制细菌的耐药性：对某种药物敏感细菌变成对该药物耐受机制产生耐药酶：水解酶、钝化酶等药物作用的靶位点改变细胞膜的通透性改变细菌主动外排一、产生药物灭活酶（一）水解酶-β-内酰胺酶是以β-内酰胺类抗菌药物为水解底物的多种同类型的降解酶。包括广谱内酰胺酶、超广谱酶β-内酰胺（ESBLs）、金属酶、AmpC酶等细菌产生的β-内酰胺酶可特异性打开β-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。ESBLs阳性菌：对所有β-内酰胺类药物耐药（二）钝化酶产生1.氨基糖苷类钝化酶2.氯霉素乙酰转移酶3.红霉素和其他灭活酶（三）修饰酶1.乙酰转移酶AAC2.核苷转移酶ANT3.磷酸转移酶APH1.青霉素结合蛋白改变2.DNA解旋酶改变三、抗菌药物渗透障碍外膜蛋白减少四、药物的主动转运系统外排作用二、药物作用靶位的改变第三节细菌耐药性检查方法常用方法耐甲氧西林葡萄球菌检测克林霉素诱导耐药试验肠球菌高水平氨基糖苷类耐药β内酰胺酶检测超广谱β内酰胺酶纸片法检测一、β-内酰胺酶检测原理：β-内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于G+球菌菌体外，G-杆菌周浆间隙。检测方法：常用头孢硝噻吩纸片法头孢硝塞吩纸片法（nitrocefintest）头孢硝塞吩的内酰胺环被β-内酰胺酶打开，基质由黄色变为红色。G+菌直接取培养物G-菌取细菌裂解液二、ESBLs检测ESBLs：扩大了原来的底物谱，可以水解青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环类抗生素。1.纸片法检测双相纸片试验2.液体稀释法检测筛选试验：头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟确证试验：头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸头孢噻肟头孢噻肟/克拉维酸双纸片协同法（初筛试验）中央是酶抑制剂（克拉维酸）周围分别是头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟纸片E-test法：稀释法判断标准：加克拉维酸MIC值较未加克拉维酸MIC值小8倍以上（即3个稀释度），即为ESBLs阳性。三、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）检测定义：对1㎍/ml苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10mm，或其MIC≥4㎍/ml的金黄色葡萄球菌；对1㎍/ml苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17mm，或其MIC≥0.5㎍/ml的凝固酶阴性葡萄球菌常用方法：头孢西丁纸片扩散法苯唑西林琼脂稀释法头孢西丁纸片法苯唑西林琼脂稀释法四、克林霉素诱导耐药试验纸片相邻试验D-抑菌环五、肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药高水平耐氨基糖苷类纸片法高浓度庆大霉素：120㎍/ml高浓度链霉素：300㎍/ml万古霉素耐药-琼脂稀释法万古霉素浓度：6㎍/ml